大豆乳状液的组成成分及相关性质的研究

胡 淼，齐宝坤，孙禹凡，谢凤英，李 杨

(东北农业大学 食品学院，哈尔滨 150030)

我国现行的食用植物油加工工艺主要有压榨法和浸出法两种。生物解离是一种新兴的植物油提取技术[1]。应用生物解离技术从高含油油料如花生、油菜籽以及紫苏籽中提取油脂，可以获得较高的油脂提取率，但是从大豆中提取油脂却很难获得较高的提取率，因为蛋白与油脂紧密结合，形成稳定的乳状液，导致其包裹的油脂难以被释放分离出来，因而限制了大豆中油脂的提取[2]。

Lamsal等[3]研究发现乳状液的主要成分为油脂、水分、多糖、蛋白质和磷脂，多糖的存在使乳状液黏度增大形成水相凝胶，进而使油滴颗粒相互分离，蛋白质和磷脂对乳状液的乳化稳定性起着重要的作用，但是对于蛋白质的空间结构及其在乳状液的界面分布形态并没有完全被解释清楚。由于在生物解离过程中磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺转变为磷脂酸，改变了乳状液的稳定性，使得乳状液难以被破除[4]。

本文主要分析大豆乳状液中主要组分含量，研究各组分间的相互作用。从乳化相破乳后的油相和非油组分分离的关联性出发，明确各组分对乳状液稳定性的影响，阐明油脂与各组分间吸附和分离关系；并通过测定乳状液粒径和流变学特性分析乳状液的界面特性，为破乳提供力学和质构学基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料与试剂

大豆：东农-42；Protex 6L碱性蛋白酶：杰能科生物工程有限公司；Alcalase 2.4L碱性蛋白酶：诺维信生物有限公司；十二烷基磺酸钠(SDS)、β-巯基乙醇：美国Sigma公司；磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，考马斯亮蓝G-250，丙酮，无水乙醇，甲醇，冰乙酸。

1.1.2 仪器与设备

JE-502电子天平，FA2004电子分析天平，FW100型高速万能粉碎机，挤压膨化机(东北农业大学自制)，ZNCL-BS电动磁力搅拌器，HH-4电热恒温水浴锅，BX53正置显微镜(OLYMPUS)，LGJ-1冷冻干燥机，GL-21M高速冷冻离心机，400型超导核磁共振光谱仪(德国Brucker公司)，mini-PROTEAN Tetra电泳仪(美国Bio-radLaboratories公司)，TNZ1-5700傅里叶红外光谱仪(英国Thermo Fisher公司)，F2000荧光光谱仪(日本日立(Hitachi)公司)，Mastersizer 2000粒度仪(英国马尔文仪器有限公司)，LGR20-W台式高速冷冻离心机，BGZ-246电热鼓风干燥箱，KDN-103F自动定氮仪，HYP-1040四十孔消化炉。

1.2 试验方法

1.2.1 酶解及乳状液分离工艺

参照王心刚等[5]优选的水酶法提取大豆油脂工艺参数进行实验。挤压膨化处理后的大豆粉与蒸馏水按照1∶6的料液比混合置于60℃的恒温水浴锅中加热，用2 mol/L NaOH溶液调节pH至9.0左右，加入Protex 6L碱性蛋白酶，酶解3 h后，在100℃下加热10 min灭酶处理，之后在4 500 r/min下离心20 min，离心后吸取游离油，将其余液体部分倒入分液漏斗，静置24 h分层后，将上层的乳状液分离。

1.2.2 乳状液成分测定

乳状液用蒸馏水洗涤后分成4份，然后离心(15 000g，30 min，25℃)回收，储存在4℃下待分析。

乳状液中粗脂肪含量测定采用酸水解的方法，参照AOCS 922.06；粗蛋白质含量测定采用凯氏定氮法，参照GB/T 5009.5—2003；总碳水化合物测定采用Fox等[6]的方法；水分含量测定采用105℃烘箱法，参照GB/T 5009.3—2003；总磷脂含量测定采用钼蓝比色法，参照GB/T 5537—2008。

1.2.3 乳状液表面蛋白含量的测定

表面蛋白含量测定按照Agboola等[7]的方法。

1.2.4 乳状液中蛋白的提取

乳状液水相中蛋白提取方法采用丙酮沉淀法[8]。将乳状液与冷丙酮按照质量体积比20∶1在-18℃下反应2 h，在12 000g、4℃下离心15 min，除去上清液，将沉淀继续用冷丙酮洗涤4～5次，直到溶剂由黄色变成无色，将沉淀中溶剂挥发后冷冻干燥得到蛋白，放入4℃冰箱备用。

1.2.5 乳状液中蛋白相关研究

1.2.5.1 红外光谱的测定

将提取的蛋白样品粉碎后过100目筛，在40℃烘箱中烘干12 h，然后在红外灯下进行研磨处理。称取约2 mg的待测样品，加入约200 mg溴化钾，在玛瑙研钵中研磨约15 min，随后进行压片处理，压片机在1.4 MPa压力下约保持1 min，然后将制得的均匀透明薄片放入红外光谱仪中进行测定。测定条件为：扫描范围400～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1，扫描信号累加64次。每种处理样的图谱扫描重复3次。采用Peakfit分析谱图。

1.2.5.2 SDS-PAGE电泳分析

采用SDS-PAGE分析乳状液中蛋白相对分子质量[9]。

具体方法：将蛋白样品与上样缓冲溶液按2∶1的比例混合，在100℃下加热90 s，蛋白的上样质量浓度为6 mg/mL，上样量为10 μL，其中分离胶的浓度为12%，浓缩胶的浓度为5%，电泳开始时的初始电流为10 mA，样品进入分离胶后改成20 mA。利用0.1%考马斯亮蓝R-250溶液进行染色，时间为30 min，之后利用甲醇和冰乙酸对样品进行脱色处理，直到溶液澄清透明为止。

1.2.5.3 荧光光谱的测定

依据尹寿伟[9]的方法。将蛋白样品分别分散于0.01 mol/L pH为7.0的磷酸缓冲液中，配制蛋白质量浓度为0.15 mg/mL的溶液。测定条件：荧光光谱的激发波长为290 nm，光谱的扫描范围为300～400 nm，激发与发射狭缝的宽均为5 nm。

1.2.6 乳状液中磷脂组成分析

1.2.6.1 毛油提取

向乳状液中加入200 mL甲醇，混合摇匀加入400 mL氯仿继续混匀，在室温下磁力搅拌4 h，然后采用布式漏斗回收固体和萃取液，将固体反复萃取，合并萃取液，将萃取液经过旋转蒸发除去溶剂，继续用氯仿、甲醇、0.74%KCl溶液按照体积比为8∶4∶3进行洗涤，得到的毛油储存在-26℃下备用。

1.2.6.2 浓缩

10 g毛油与45 mL正己烷和15 mL乙醇混合，5 min达到平衡后收集乙醇相，此过程重复10次，之后乙醇提取物与130 mL氯仿和111 mL EDTA(pH 7)混合，收集氯仿相，采用硫酸钠干燥，然后除去溶剂的浓缩油在-26℃储存待用。

1.2.6.3 磷脂的测定

乳状液磷脂测定采用31P NMR分析。浓缩油(80～90 mg)加入TPP(10 mg，固体)，溶解于氯仿、甲醇、EDTA组成混合液中，剧烈振荡摇匀，离心后将下层转移到5 mm NMR瓶中进行测定。

31P NMR测定条件：探头温度29℃，脉冲宽度22 μs，扫描宽度9 718 Hz，采集时间1～2 s，间隔10 s，扫描次数256次。

1.2.7 乳状液性质的测定

1.2.7.1 乳状液粒径及电位的测定

采用粒度分析仪测定乳状液体积加权平均值(D4,3)。将小部分乳状液分散在50 mL蒸馏水中，保持粒径数值在测定范围内，大豆油滴的折射指数(RI)为1.47，分散剂的RI为1.333。测定在室温下进行，吸光值为0.001。

采用Zeta电位仪测定乳状液的Zeta电位。将大豆乳状液样品用50 mmol/L pH 7的磷酸缓冲液稀释至样品质量分数为0.2%的溶液后，在25℃下进行测定。

1.2.7.2 乳状液激光共聚焦分析

分别将0.01%的尼罗红和0.01%的尼罗蓝溶解在异丙醇中，制成染色液。取1 mL乳状液样品，分别加入40 μL尼罗红染色液和40 μL尼罗蓝染色液，混合均匀后，染色20 min，取染色后的乳状液样品1滴放在带凹槽的载玻片上，盖上盖玻片并用甘油密封。采用油镜进行图像的采集，观察的分辨率为1 024×1 024，图像采集的范围为5～45 μm。

1.2.7.3 乳状液流变性质的测定

采用流变仪测定乳状液的流变学变化。测定的剪切速率为5 s-1，升温速度为5℃/min，观察此时乳状液的黏度随温度的变化规律。在25℃下，采用流变仪观察黏度随剪切速率的变化规律。

1.2.7.4 正置显微镜分析

用吸管取2～3滴乳状液于干净干燥的载玻片上，轻轻地加上盖玻片后，置于显微镜明场放大100倍进行观察。

1.2.8 数据分析

为保证试验数据的准确性，每组试验进行3次平行试验，并将试验数据进行误差分析。采用SPSS 19统计软件进行单因素方差分析和差异显著性分析，采用Origin 8.5软件进行绘图。

2 结果与讨论

2.1 乳状液组成

2.1.1 乳状液的化学组成(见表1)

表1 大豆粉及乳状液主要成分 %

注：表中数据为湿基含量。

由表1可知，乳状液中的两种主要成分为甘油三酯(油脂)和水，含量分别达到66%和29%。此外，还有少量的碳水化合物、蛋白质和磷脂。虽然乳状液中蛋白质含量仅占4.7%，磷脂含量仅占0.8%，但由于其特殊的双亲结构对乳状液的形成和稳定起着重要的作用。碳水化合物主要包括淀粉和纤维颗粒，可有效增加吸附层界面黏度，降低界面张力，同时在液滴间形成静电斥力，阻碍液滴的絮凝和聚集，提高了乳状液的稳定性。

2.1.2 乳状液中蛋白分析

乳状液中蛋白的SDS-PAGE图见图1，内源荧光光谱图见图2。

由图1可知，大豆分离蛋白的亚基分布范围较广，相对分子质量主要分布在17～20 kDa和48～63 kDa。而乳状液中蛋白在17～20 kDa范围内的条带明显变浅，在48～63 kDa范围内的条带全部消失，亚基分布范围较窄且相对分子质量较小，相对分子质量主要分布在11～17 kDa范围内。相比于大豆分离蛋白，大豆乳状液中蛋白相对分子质量减小的原因主要是由于水酶法提取大豆油过程中蛋白酶的水解作用，使大豆蛋白水解成相对分子质量较小的多肽导致的。低相对分子质量蛋白可能是oleosin蛋白，其包围在油体表面并且具有双亲性，一般相对分子质量分布在15～26 kDa，这取决于蛋白质亚型和植物种类[10]。

注：M.蛋白质标样Marker；1.大豆分离蛋白；2.乳状液中蛋白。

图1大豆乳状液中蛋白的SDS-PAGE图

图2 大豆乳状液中蛋白的内源荧光光谱图

由图2可知，大豆乳状液中蛋白的荧光强度为377.82±6.86时，有最大吸收波长λmax，为(346.15±0.27)nm。Keerati-u-rai等[11]对油-水界面中的大豆蛋白的内源荧光光谱进行测定与分析，得到与本文类似的研究结果。Miriani等[12]采用荧光光谱对吸附在乳状液界面的大豆蛋白结构特性进行研究，与天然的蛋白质(β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白)相比，乳状液中蛋白的最大发射波长由7 nm增大到12 nm，即发生红移，表明蛋白吸附后更多的色氨酸残基暴露到水相中，三级结构变得更加松散。位于蛋白质亚基中的色氨酸残基暴露到水相后，色氨酸的疏水区域被固定在乳状液界面中，起到稳定乳状液的作用。

图3为大豆乳状液中蛋白的红外光谱图。

图3 大豆乳状液中蛋白的红外光谱

采用Peakfit软件对蛋白红外光谱酰胺Ⅰ带进行二阶导数红外去卷积光谱拟合，评价蛋白二级结构类型和含量，酰胺Ⅰ带拟合图谱中各子峰与蛋白二级结构对应关系见表2。

表2 乳状液中蛋白二级结构信息

2.1.3 乳状液中磷脂组成

图4为分别为大豆粉、膨化大豆粉和大豆乳状液中磷脂含量。

注：PA.磷脂酸；PG.磷脂酰甘油；DPG.双磷脂酰甘油；PE.磷脂酰乙醇胺；PS.磷脂酰丝氨酸；PI.磷脂酰肌醇；PC.磷脂酰胆碱。

图4大豆粉、膨化大豆粉和大豆乳状液中磷脂含量

由图4可知，挤压膨化后PA含量升高到(14.1±0.98)%，比大豆粉中的PA含量(9.12±1.13)%高；PC和PE含量降低，分别由48.26%降低到45.5%，20.11%降至18.2%，这可能是在挤压膨化过程中需要将水分调节到14%，而14%恰好是磷脂酶D的活跃水分，磷脂酶D可能水解PC和PE。与膨化物料相比，大豆乳状液磷脂中的PA含量升高，PC和PE含量降低，PI、DPG和PS全过程变化不明显，可能由于在水酶法酶解过程中，磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺转变为磷脂酸，这种变化可能会影响乳状液的稳定性[14-15]。

2.2 乳状液稳定性分析

2.2.1 乳状液的结构性质

经测定，大豆乳状液的界面蛋白含量为(10.79±0.84)mg/m2，而Tcholakova等[15]研究发现在油滴界面能够形成单层蛋白膜稳定乳化体系，形成稳定乳状液的最低界面蛋白含量为1～2 mg/m2，生物解离得到的大豆乳状液的界面蛋白含量是形成稳定乳状液最低界面蛋白含量的好几倍，表明乳状液的油滴界面由多层蛋白膜包裹形成，足以形成一个稳定的多层乳液。

乳状液的平均粒径可以反映液滴的聚集情况。经测定大豆乳状液的平均粒径(D4，3)为(11.13±0.58)μm，比花生水酶法提油形成的乳状液粒径小，说明水酶法提取大豆油过程中能够形成稳定的乳状液体系。研究表明乳状液由于静电排斥作用的存在，带电量越多，其稳定性越好，大豆乳状液的Zeta电位值为(-21.57±1.88)mV，说明乳状液具有较强的稳定性。采用正置显微镜观察乳状液的微观结构(见图5A)，可以看出本试验的乳状液中油滴尺寸较小，且分散较均匀，这也说明了未处理的乳状液的稳定性较好。通过激光共聚焦观察乳状液的微观结构(见图5B)，可以看出油滴被蛋白包裹，使得油脂无法聚集释放，形成相对稳定的乳状液。

图5 乳状液的显微结构图(A)和激光共聚焦图(B)

2.2.2 乳状液的流变性质(见图6)

由图6A可知，随着剪切速率的增加，乳状液的黏度逐渐降低，最终达到平衡。乳状液呈现出剪切变稀的性质，在低剪切速率(0.1～2 s-1)下，乳状液黏度由300 Pa·s迅速下降到1 Pa·s以下。此后，再继续增加剪切速率，乳状液黏度进一步下降，但是下降的速度缓慢，最终在高剪切速率(8～10 s-1)下，乳状液黏度变化不显著。这表明乳状液黏度受剪切作用的影响较大，较小的剪切速率就能破坏乳状液油水界面膜的结构，使乳状液的稳定性下降，这可能是由于蛋白质、磷脂等两性物质稳定的乳化体系受到剪切作用时，分子之间的交联作用被破坏导致的。

图6 不同剪切速率和温度下乳状液的黏度

由图6B可知，随着温度的升高，乳状液黏度呈先降低后稍有增加的趋势。当温度由25℃升高到90℃时，乳状液黏度显著降低。这可能是由于提高温度加快了乳状液中分子的热运动，破坏了油、水界面膜中分子之间的作用力，减弱了分子间的相互作用，使体系的流动性增加，黏度降低。此外，热处理会使吸附在油滴表面的蛋白发生热变性，使其失去乳化能力，导致乳化体系被破坏，从而降低了体系黏度。当温度超过90℃后，黏度稍有增加。这可能是由于高温导致水分的严重蒸发而蛋白还未变性，这会使体系浓度急剧增大，蛋白质等分子聚合形成较大聚集物，导致体系黏度稍有增加。Dimitrova等[16]研究表明，随着温度的升高，乳状液由非絮凝状态转变为絮凝状态，使乳状液的黏度发生改变，导致乳状液稳定性降低。Hanmoungjai等[17]采用Alcalase 碱性蛋白酶提取米糠油，酶解后将得到的乳状液煮沸破坏乳化体系，使油脂与蛋白分离，这说明高温能够使乳状液的稳定性降低，这与本研究的结果相似。

3 结 论

本文探究了生物解离大豆乳状液的成分及各组分的结构，发现生物解离大豆乳状液的主要成分为油脂、水、蛋白质和磷脂，蛋白质的相对分子质量降低，蛋白质结构松散，二级结构的含量与大豆蛋白结构相似，磷脂主要由PC、PE、PG、PI、PA、DPG和PS组成，其中PC含量最高，蛋白质和磷脂对稳定乳状液起关键作用。同时，表面蛋白起着稳定乳状液的作用，乳状液的稳定性受剪切速率和温度的影响。通过以上的研究可以发现利用酶解的作用可以有效地破除乳状液，提高油脂的产率。