携带blaKPC-2基因肺炎克雷伯菌引起儿童医院感染暴发的研究

张 会，赵 辉,董丹丹，刘真真，贾 楠，朱元祺，*

(1.青岛大学医学院，山东 青岛 266071;2.青岛大学附属医院 检验科，山东 青岛 266555)

自2001年Yigit等[1]第一个报道产肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC)临床分离株以来，携带blaKPC-2基因肠杆菌在世界各地传播开来。2007年国内Wei等首次报道产KPC-2酶的肺炎克雷伯菌浙江分离株。此后，全国各地陆续有检出KPC-2阳性菌株报道[2]。我们收集2017年4月某儿童医院分离的碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌株，对其耐药表型、耐药基因以及同源性进行研究，以便为采取医院感染控制措施提供依据，现报道如下。

1 材料和方法

1.1菌株和病人资料9株肺炎克雷伯菌来源于2017年4月分离自某儿童医院心血管外科(5株)、心血管科(2株)和新生儿科(2株)住院患儿。对病人的病例资料进行回顾性分析，按照2010年1月21日卫生部颁布的《医院感染诊断标准(试行)》，根据病例资料判定这9例患儿的感染都属于医院感染。

菌株鉴定和药敏试验采用Vitek-2 Compact系统。药敏结果判定依据美国临床实验室标准化委员会制定CLSI-M100(2017)标准。仪器质控菌株为ATCC25922、ATCC35218、ATCC700603和ATCC27853。

1.2主要仪器和试剂MyCycle型PCR扩增仪和CHEF MAPPER XA型脉冲场凝胶电泳仪为美国Bio-RAD公司； HP3400型全自动凝胶成像系统为美国Alpha Innotech公司。基因组提取试剂盒、琼脂糖、PCR试剂和核酸分子量标准为大连宝生生物。

1.3耐药基因的检测分别检测碳青霉烯类耐药基因(blaKPC、blaNDM、blaBIC、blaOXA-48、blaIMP、blaSPM、blaVIM、blaAIM、blaGIM、blaDIM和blaSIM)和超广谱β-内酰胺酶耐药基因(blaCTX-M、blaSHV、blaTEM和blaOXA-1)。耐药基因的PCR扩增引物序列和方法参照文献[3]。引物合成和产物测序由生工(上海)生物技术有限公司完成。

1.4多位点序列分型按网站(http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html)提供的7个管家基因(gapA、infB、mdh、pgi、phoE、tonB、rpoB)引物序列和扩增条件进行菌株的多位点序列分型(MLST)。

1.5脉冲场凝胶电泳脉冲场凝胶电泳(PFGE)的具体操作步骤和结果解释依据参考文献和Tenover规则[3,4]。利用BioNumerics7.6软件，依据Dice系数和UPGMA聚类对脉冲场凝胶电泳进行分析。

2 结果

2.1菌株的药敏和耐药基因检测结果

除了磺胺甲恶唑/甲氧苄啶外， 9株肺炎克雷伯菌对头孢菌素类、头霉素类、碳青霉烯酶类、氨基糖苷类和喹诺酮类等抗菌药物都表现耐药。经PCR扩增和测序证实，所有菌株都携带blaKPC-2基因，其中8株菌还同时携带blaCTX-M-65、blaSHV-12和blaTEM-1B基因。结果详见表1。

表1 产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌对抗菌药物的药敏结果和携带的基因

2.2菌株多位点序列分型和脉冲场凝胶电泳结果

经对每株菌7个管家基因的扩增、测序和网站比对，除了一株为ST278型外，其他8株菌属于ST11型。根据Tenover脉冲场凝胶电泳按条带解释规则，9株肺炎克雷伯菌分为A、B两个型。其中，H2、H5、H6和H8号菌株为A型，H3、H4和H10号菌株为A1型，H7号菌株为A2型，H1号菌株为B型。A型及其亚型这8株菌的条带位置及数目相差小于3条，其多位点序列分型都是ST11型，且相互间脉冲场凝胶电泳聚类分析有92.8%-100%的相似度，这表明存在克隆聚集性。但这8株ST11型与ST278型肺炎克雷伯菌的聚类分析相似度为64.3%，表明存在另一个克隆株。详见图1。

注: NO：菌株编号；MLST：多位点序列分型；Date：分离时间；Ward：分离科室；Sample：标本类型。

3 讨论

Logan等[5]报道目前国际上碳青霉烯酶耐药肠杆菌(CRE)产生机制主要是产碳青霉烯酶，ESBLs和/或AmpC合并细菌膜蛋白结构改变。Ambler分类中的碳青霉烯酶包括A、B和D类酶。KPC是A类中最常见的类型。国外代表株是携带blaKPC-2或blaKPC-3的ST258型肺炎克雷伯菌，而国内是以携带blaKPC-2的ST11型肺炎克雷伯菌最为常见[6]。Tn4401为主要的相关可移动遗传元件。B类酶又称金属酶，以IMP和NDM为主。IMP主要分布在中国、日本和澳大利亚，其中国内以IMP-4和IMP-8多见，常见的相关可移动遗传元件有IncL/M、IncA/C和I类整合子等；NDM分布于世界各地，常见相关移动遗传元件有IncA/C和ISAba125等。D类酶主要是OXA-48，我国报道不多，常见于日本、欧洲和北非，代表菌是肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌，相关可移动遗传元件有IncL/M、Tn1999、IS1999等[7]。

儿童作为特殊群体，由于对四环素类、喹诺酮类和氨基糖苷类抗生素的使用受到限制，这使临床在治疗儿童感染耐碳青霉烯类肠杆菌时会面对更多的困难。本研究中，8株携带blaKPC-2基因的ST11型肺炎克雷伯菌分离自儿童医院心血管外科、心血管科和新生儿科的住院患儿，分离时间上相近，耐药表型一致，脉冲场凝胶电泳条带分布相差小于3条，根据医院感染诊断标准和Tenover规则，判断在这三个科室病房患儿中存在携带blaKPC-2肺炎克雷伯菌的暴发流行。

近年来，国内外均有碳青霉烯类耐药肠杆菌在儿童或新生儿群体中暴发感染的报道[8,9]。目前的研究显示，感染多与抗生素的不合理使用、侵入性操作、菌株定植和住院时间延长等因素有关[10]。由于是回顾性研究，我们没能采集医院科室环境标本，以进一步查找感染源和感染途径。下一步，我们将继续进行该流行株的基因转移元件及基因环境的研究。

经检索，尽管有携带blaKPC-2基因的ST11型肺炎克雷伯菌散发和暴发的病例报道[9]，但没有与该流行菌株携带的其他耐药基因相一致的报道，即携带blaKPC-2、blaCTX-M-65、blaSHV-12和blaTEM-1B基因的ST11型肺炎克雷伯菌引起病房患儿医院感染暴发是国内外首次报道。因此，应引起临床重视，并加强对碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌的监测和抗生素的合理使用。