回顾分析174例FISH和IHC全自动平台检测HER-2基因的状态

林云恩　龙惠东　韩秀晶　秦积龙　谭小军

【摘要】 目的：分析全自動免疫组化（IHC）和荧光原位杂交（FISH）技术平台检测乳腺浸润性导管癌患者的HER-2蛋白（即C-erbB2蛋白）和HER-2基因扩增的结果的一致性，分析蛋白基因表达状况与临床病理特征的关系。方法：回顾性分析174例乳腺浸润性导管癌患者的临床资料，样本经手术、麦默通活检或穿刺取样。分析IHC和FISH检测结果;比较IHC检测C-erbB2蛋白与FISH检测HER-2基因的一致性;分析FISH与IHC检测结果与ER、PR及临床病理参数的关系。结果：FISH检测显示，HER-2基因无扩增表达（-）101例、HER-2基因有不同程度的扩增表达（+）73例;IHC检测显示，C-erbB2蛋白（-）、（+）、（++）、（+++）分别为4、15、114、41例;C-erbB2蛋白（+）和HER-2基因扩增（-）的一致率86.7%（13/15），C-erbB2蛋白（++）和HER-2基因扩增（-）的一致率70.1%（81/114），C-erbB2蛋白（+++）和HER-2基因扩增（+）的一致率92.7%（38/41），两者阳性结果具有高度一致性（Kappa=0.766，P<0.001）;FISH检测结果与年龄有关（P<0.05），IHC检测结果与组织学分级有关（P<0.05），两种检测方法结果与肿瘤直径、淋巴结转移、ER、PR状态等均无关（P>0.05）。结论：可以利用一致性非常好的IHC和FISH两大平台来检测乳腺浸润性导管癌HER-2蛋白和基因的表达状态，以协助临床用药指导;IHC相对价格便宜，初步筛查蛋白结果，可以优先采用，对于结果为不确定的（++）IHC检测标本，再进一步应用FISH法明确HER-2基因扩增状态，以免误导临床;检测操作和阅片判读过程中规范化流程和高科技仪器设备起到很好的辅助作用。

【关键词】 乳腺癌 HER-2基因 荧光原位杂交 全自动免疫组化

Retrospective Analysis of 174 Cases of HER-2 Gene Status Detection by FISH and IHC Automatic Platform/LIN Yunen， LONG Huidong， HAN Xiujing， QIN Jilong， TAN Xiaojun. //Medical Innovation of China， 2019， 16（29）： 0-028

[Abstract] Objective： To analyze the consistency of HER-2 protein （C-erbB2 protein） and HER-2 gene amplification in breast infiltrating ductal carcinoma patients detected by full automatic immunohistochemistry （IHC） and fluorescence in situhybridization （FISH） technology platform， and to analyze the relationship between the expression of protein gene and clinical pathological characteristics. Method： The clinical data of 174 patients with breast infiltrating ductal carcinoma were retrospectively analyzed. Samples were taken by surgery， Mammotome biopsy or puncture. The results of IHC and FISH were analyzed， the consistency of C-erbB2 protein detected by IHC and HER-2 gene detected by FISH was compared， and the relationship between FISH and IHC results and ER， PR and clinicopathological parameters was analyzed. Result： FISH detection showed that 101 cases of HER-2 gene had no amplified expression （-） and 73 cases of HER-2 gene had amplified expression （+）. IHC detection showed that C-erbB2 protein （-） （+） （++） （+++） was 4， 15， 114 and 41 cases respectively. The consistency rate of C-erbB2 protein （+） and HER-2 gene amplification （-） was 86.7% （13/15）， the consistency of C-erbB2 protein （++） and HER-2 gene amplification （-） was 70.1% （81/114）， the consistency rate of C-erbB2 protein （+++） and HER-2 gene amplification （+） was 92.7% （38/41）， the positive results were highly consistent （Kappa=0.766， P<0.001）. FISH results were correlated with age （P<0.05）， IHC results were correlated with histological grade （P<0.05）， and the results of the two methods were not correlated with tumor diameter， lymph node metastasis， ER and PR status （P>0.05）. Conclusion： The two platforms of IHC and FISH with good consistency can be used to detect the expression of HER-2 protein and gene in invasive ductal carcinoma of breast， so as to assist in clinical medication guidance. IHC is relatively inexpensive， and the preliminary results of screening protein can be preferred. For samples with uncertain results （++） IHC detection， FISH method is further applied to determine the amplification status of HER-2 gene in order to avoid misleading clinical practice. The standardized process and high-tech instruments and equipment play a very good auxiliary role in the process of test operation and film reading and interpretation.

[Key words] Breast cancer HER-2 gene Fluorescence in situ hybridization Automated immunohistochemistry

First-authors address： Affiliated Cancer Hospital and Insititute of Guangzhou Medical University， Guangzhou 510095， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.29.006

乳腺癌给女性健康造成极大的威胁，发病率正逐年攀升，女性肿瘤排位是最常见的恶性肿瘤之一[1]。人类表皮生长因子受体2（humanepidermal growth factor receptor-2，HER-2）是一种原癌基因，此基因位点在于17号染色体的长臂上，其表达产物为是一种跨膜蛋白：C-erbB2，此蛋白具有酪氨酸激酶活性。肿瘤中C-erbB2过表达，提示分化低、恶性度高、预后差，在乳腺浸润性导管癌中被认为是仅次于淋巴结状况的独立预后指标[2]。目前，人源化的抗HER-2的单克隆抗体曲妥珠单抗（赫塞汀）已应用于肿瘤患者的治疗，该药物作用于HER-2受体的细胞外部分，阻止细胞內酪氨酸激酶活化，抑制依赖HER-2的肿瘤细胞的增殖和存活。研究发现，HER-2基因在10%～25%的乳腺癌中存在过表达[3]，HER-2基因扩增与否可用于指导靶向治疗及化疗药物治疗等方案的选择。HER-2基因的检测结果是乳腺癌靶向治疗选择的重要依据，同时对内分泌治疗、化疗方案的选择及预后评估具有临床指导意义。因此，HER-2蛋白（即C-erbB2蛋白）表达水平和基因扩增与否备受关注，而病理学检测C-erbB2蛋白和基因表达是核心步骤。随着全自动的免疫组化（immunohistochemistry，IHC）和荧光原位杂交（fluorescence in situhybridization，FISH）分析技术日益成熟，相比较传统手工的IHC，分子病理诊断结果具有更高的准确度，同时具有标准化、灵敏性高等优点，有着广泛的应用和发展前景。但是对于两种检测系统在C-erbB2蛋白表达水平和基因扩增的临床检测中的优势，以及C-erbB2蛋白表达水平和基因扩增结果在临床应用中评价仍需要临床数据支持。本文回顾分析了174例乳腺浸润性导管癌患者的病理标本，运用IHC和FISH两个不同平台，利用前后组织面，同时检测C-erbB2蛋白表达和HER-2基因扩增的状态，减少组织不同层面异质性的干扰，运用统计学工具分析两个平台检测结果的一致率。总结经验，不断提高技术操作和病理阅片的一致性，同时讨论其与临床病理的关系，以期为乳腺癌的临床治疗和预后判断提供更准确的参考和依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 样本来源于广州医科大学附属肿瘤医院病理科2017年3月-2019年2月经手术、麦默通活检或者穿刺取样的174例乳腺浸润性导管癌标本。纳入标准：均确诊为浸润性导管癌;女性患者。排除标准：患者术前接受其他临床治疗。其中年龄28～72岁，平均（47.4±6.1）岁;全部切片经两位高年资病理医生复查阅片，所有样本均用10%中性缓冲福尔马林液固定，石蜡包埋，切片厚度3 μm，连续切片6张，①②③号分别染色雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、C-erbB2蛋白，④号切片进行FISH检测，⑤号保留后备，⑥号切片染HE。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂 ER、PR兔抗人单克隆抗体购自基因科技（上海）股份有限公司;HER-2兔抗人单克隆抗体购自罗氏诊断产品有限公司;乳腺癌HER-2基因扩增诊断试剂盒购自雅培Vysis公司。

1.2.2 主要设备 Dako Omnis全自动免疫组化仪（购自安捷伦科技有限公司）;Roche Ventana Benchmark XT全自动免疫组化仪（购自罗氏诊断产品有限公司）;荧光显微镜（购自日本Olympas公司）;雅培Bioview全自动荧光原位杂交扫描分析系统（购自雅培Vysis公司）。

1.2.3 FISH检测 操作步骤如下：切片在环保透明剂中脱蜡、100%、95%、75%梯度酒精复水，于双蒸水中洗3 min，在氯化钠柠檬酸钠缓冲液（pH=7.0，简称2×SSC缓冲液）中漂洗3 min，将切片浸没在80 ℃的预处理液NaSCN中13 min，双蒸水洗30 s，2×SSC缓冲液洗30 s，用纸巾吸干组织边缘液体，将玻片浸没在蛋白酶工作液中，37 ℃作用15 min;依次在浓度75%、95%、100%乙醇中梯度脱水

30 s，室温干片。再避光滴加HER-2探针10 μL，加盖玻片，橡胶水泥封边，75 ℃变性5 min，42 ℃杂交仪中过夜。第2天玻片去胶去盖玻片后，Vysis Wash Buffer Ⅰ室温作用5 min（盖玻片去除后开始计时），移入预热到72 ℃的Vysis Wash Buffer Ⅱ中作用2 min，双蒸水洗1 min;室温晾干，滴加DAPI细胞核复染剂，加盖玻片，静置20 min后于雅培Bioview全自动荧光原位杂交扫描分析系统下观察染色、计数。

1.2.4 IHC（HER-2、ER、PR）检测 切片在57 ℃烤箱烤片过夜，第2天上机Roche Ventana Benchmark XT全自动免疫组化仪进行检测，程序如下。脱蜡：EZ Prep 76 ℃作用4 min，反应缓冲液（Reaction Buffer，RB）冲洗;抗原修复：pH 8.0～8.5免疫组化抗原修复缓冲液（CC1）100 ℃作用15 min，RB冲洗;封闭：3%H2O2封闭内源性抗原，37 ℃作用4 min，RB冲洗;一抗（HER-2、ER、PR）：37 ℃作用12 min，RB冲洗;二抗：检测系统（ultraview universal DAB detection kit）HRP multimer 37 ℃作用8 min，RB冲洗;DAB显色：检测系统DAB 37 ℃作用8 min，RB冲洗;强化：检测系统Copper 37 ℃作用4 min，RB冲洗;衬染：苏木素37 ℃作用8 min，RB冲洗;返蓝：返蓝液37 ℃作用8 min，RB冲洗;取出染色完成的玻片，用含清洁剂的清水冲洗玻片上多余的油质，常规梯度酒精脱水、环保透明剂透明后，用中性树胶封片;显微镜下观察着色、评分。

1.3 结果判定 FISH结果判定根据2019版中国乳腺癌HER-2检测指南[4];IHC（C-erbB2蛋白）结果判定根据2019版中国乳腺癌HER-2检测指南[4]，其中（-）和（+）为阴性结果，（+++）为阳性结果，（++）为不确定病例;IHC（ER、PR）结果判定参照Falleni等[5]的方法。

1.4 观察指标 分析IHC和FISH检测结果;比较IHC检测C-erbB2蛋白与FISH检测HER-2基因的一致性;分析FISH与IHC检测结果与ER、PR及临床病理参数的关系。

1.5 统计学处理 使用SPSS 18.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，组间比较采用t检验;计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验;一致性采用Kappa检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IHC和FISH检测结果分析 174例乳腺浸润性导管癌FISH检测显示，58.0%（101/174）HER-2基因无扩增表达，HER-2（-）示红绿信号呈双体性，见图1;42.0%（73/174）HER-2基因有不同程度的扩增，HER-2（+）示红信号点簇状扩增，见图2。IHC检测显示，C-erbB2蛋白（-）（+）（++）（+++）分别为4、15、114、41例，其中C-erbB2蛋白（-）示肿瘤细胞膜无表达，见图3;C-erbB2蛋白（+）示肿瘤细胞膜淡黄色半连续表达，见图4;C-erbB2蛋白（++）示肿瘤细胞膜黄色连续表达，见图5;C-erbB2蛋白（+++）示肿瘤细胞膜褐色连续强表达，见图6;本组IHC检测C-erbB2蛋白阳性表达率23.6%（41/174）。

2.2 IHC和FISH检测结果一致性检验 C-erbB2蛋白（+）和HER-2基因扩增（-）的一致率86.7%（13/15），C-erbB2蛋白（++）和HER-2基因扩增（-）的一致率70.1%（81/114），C-erbB2蛋白（+++）和HER-2基因扩增（+）的一致率92.7%（38/41），两者阳性结果具有高度一致性（Kappa=0.766，P<0.001）;扩大范围，将阴性、阳性病例同时进行一致性分析显示，IHC检测C-erbB2蛋白（-/+）和（+++）与FISH检测HER-2基因扩增具有中等一致性（Kappa=0.434，P=0.022）。见表1。

2.3 FISH、IHC检测结果与ER、PR及临床病理参数的关系分析 FISH检测结果与年龄有关（P<0.05），IHC检测结果与组织学分级有关（P<0.05）;两种检测方法结果与肿瘤直径、淋巴结转移、ER、PR状态等均无关（P>0.05）。见表2。

3 讨论

随着分子生物学的发展，FISH的应用给传统病理学带来了一场革命，使纯形态的病理学发展成了形态学与免疫学及分子生物学相结合的现代病理学，为病理学的教学与科研工作提供了极为有力的帮助。FISH技术检测HER-2基因是实体瘤分子应用成熟的典型之一，HER-2基因扩增是乳腺癌发病的主要机制，其扩增会影响肿瘤生长与扩散能力，影响肿瘤对治疗的反应。而曲妥珠单抗是一种重组DNA衍生的人源化单克隆抗体，能特异地作用于HER-2受体过表达的乳腺癌细胞，可降低复发率和死亡率，提高生存期，改善预后，在HER-2阳性乳腺癌患者术后辅助治疗和转移性一线治疗中的作用已被公认，曲妥珠单抗是美国食品和药品管理局（FDA）认证的第一个治疗乳腺癌的分子靶向药物，因其价格昂贵，同时乳腺癌化疗药物存在心脏毒性的潜在风险[6]，所以HER-2基因表达扩增状态和ER、PR激素相关的检测至关重要。

目前，IHC和FISH是臨床上评价乳腺癌HER-2基因状态最常用的两种方法。传统手工IHC由于成本低、方法成熟;全自动IHC最大限度去除人为影响因素、结果稳定、可重复性高，IHC染色能长期保存，在临床广泛运用。FISH技术是一种分子细胞遗传学技术，具有快速、检测信号强、杂交特异性高等特点，对目的基因进行定性定量及定位分析，具有高稳定性、高准确性的优点，配合Bioview全自动荧光原位杂交扫描分析系统，有效避免主观误差，因此，Roche Ventana全自动IHC检测C-erbB2蛋白表达和FISH检测HER-2基因扩增是国际推荐的标准。

本次回顾分析结果显示，FISH检测结果与年龄有关（P<0.05），IHC检测结果与组织学分级有关（P<0.05），两种检测方法结果与肿瘤直径、淋巴结转移、ER、PR状态等均无关（P>0.05）。作为激素依赖性器官，乳腺标本ER、PR阴性作为预后不良特征已得到公认，本研究HER-2基因扩增与ER和PR阴性状态无关（P>0.05），与文献[7-8]报道有出入。考虑到不同人种、不同地区患者乳腺癌的生物学行为可能存在差异，入组样本的选择可能存在一定的偏差，有待进一步扩大数据和样本的总结分析。本研究结果显示，IHC检测C-erbB2蛋白（-/+）和（+++）与FISH检测HER-2基因扩增具有中等一致性（Kappa=0.434，P=0.022）。当IHC检测结果为（++）时，很有必要进行FISH检测进一步验证[9-12]。很多因素可能导致检测结果的个别差异：（1）标本的固定、温湿度变化等，均可能造成标本蛋白和基因的破坏;（2）虽然在SOP的规范下操作和阅片，但主观意识和细心用心，也会使得包括肿瘤自身异质性在内的因素导致结果的不一致;（3）对于HER-2相关实验数据的各种不同，与肿瘤选择的类型、项目检测所使用的平台，以及HER-2基因的活化与否均存在一定的相关性。

因此，临床病理除了提升技师、医师的主观能动性和认真负责的态度，同时运用FISH和IHC两大平台互补，检测C-erbB2蛋白基因状态有很大的必要性。本实验采用DAKO Omnis检测ER、PR和国际标准的Roche Ventana Benchmark XT检测C-erbB2蛋白水平，减少人为因素的影响，让实验更加客观、可靠。雅培Bioview全自动荧光原位杂交扫描分析系统是通过软件控制载玻片自动进样扫描，控制显微镜自动查找细胞，并且进行各种探针图像捕捉，并自动去除背景，自动合成彩色的图片的集成系统。Bioview全自动荧光原位杂交扫描分析系统可以大大降低工作人员的强度，并且在同一个标准的控制下，提高了分析判断的准确度，并且利用现代化的高科技手段，可以快速实现多方多终端会诊及远程诊断。

综上所述，笔者认为：（1）当C-erbB2蛋白表达为（-/+）或（+++）时，IHC和FISH检测的一致性较高，如果患者条件允许，IHC检测结果为（+）或者（+++）时也建议做FISH确认;而当C-erbB2蛋白表达为（++）时，必须进行FISH检测;（2）乳腺癌HER-2基因状态与患者年龄和组织学分级有着一定的关系，对判断乳腺癌预后及拟定治疗方案有重要临床意义;（3）推进规范化培训，加强沟通，让技师操作和医生阅片的标准保持高度一致性;（4）充分利用仪器设备和高科技分析软件，解放人力的同时提升分子病理报告精准度。

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（收稿日期：2019-05-31） （本文编辑：董悦）