桑葚花色苷提取工艺优化及抗氧化活性研究

杨美莲，樊志峰，蔡圣宝，曹建新，程桂广，赵天瑞

(昆明理工大学 云南省食品安全研究院，云南 昆明 650500)

桑葚是桑科落叶乔木桑树(MorusalbaLinn)的果实，在大多数国家均有红桑(Morusrubra)、黑桑(Morusnigra)和白桑(Morusalba)，由于其味道鲜美，色泽悦目，热量低和营养高[1]，通常加工成果酒、果汁和果酱[2].桑葚中富含氨基酸、脂肪酸、矿物质、多酚和多糖等生物活性物质[3]，常用于退烧，治疗喉咙痛，肝肾保护，改善视力和降低血压等[4].桑葚药理研究发现果实提取物具有神经保护、抗氧化、抗肥胖作用、预防心血管疾病、抗动脉粥样硬化、抗血栓形成、免疫调节和抗肿瘤活性等生物活性[5-7].

花青素是桑葚中主要的多酚，含量高于蓝莓、黑莓、黑加仑和红醋栗[8].花青素3-O-葡萄糖苷、花青素3-O-芸香苷、天竺葵素3-O-葡萄糖苷和天竺葵素3-O-芸香苷是桑葚中的主要花青素[9].花青素不仅是是桑葚颜色的主要来源，同时也是其促进健康的关键成分[10].丁乐等[11]研究发现桑葚花色苷粗提物高中剂量组能降低心肌线粒体中MDA含量，升高心肌线粒体中SOD量，较低剂量组和正常组具有显著性差异(P<0.05)，对小鼠常压缺氧和心肌缺血实验具有保护作用.裴蕾等[12]研究发现桑葚花色苷提取物可以改善由高脂酒精膳食所引起的小鼠棕色脂肪组织的形态学改变和功能抑制，可防治慢性代谢性疾病.

近年来，人们开展了许多对桑葚活性成分及药理作用的相关研究，为桑葚资源的高效利用和相关功能性生物制品的研制开发以及桑葚功能食品的开发利用奠定了一定的基础.本研究探讨了桑葚花色苷的最佳提取工艺条件，并评价其纯化前后的抗氧化能力，为得到更多的桑葚花色苷资源提供有利的参考.

1 材料仪器和方法

1.1 材料和仪器

桑葚样品2017年2月购自于四川成都，经冷冻干燥后打粉过0.216 mm筛备用.

甲醇、乙醇、丙酮、乙腈：天津市津东天正精细化学试剂厂；碳酸钠：四川西陇化工有限公司；TPTZ、DPPH、ABTS、福林酚试剂、没食子酸标准品(分析纯)购于Sigma-Aldrich 公司；大孔吸附树脂：AB-8、NKA-9、NKA-2、HPD-100、XAD-16、HPD-750购于北京索莱宝生物科技有限公司，LSD-296、LSD-762购于沧州宝恩吸附材料科技有限公司；蒸馏水(自备).

电子天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；AS10200BT型超声波清洗仪：天津市奥特赛恩斯仪器有限公司；TGL20B型高速旋转离心机：上海安亭科学仪器厂；旋转蒸发器：上海爱郎仪器有限公司；UV-5100BPC型紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；pH计：上海阔思电子有限公司.

1.2 方法

1.2.1 花色苷的提取

准确称取1 g桑葚粉末加入不同的酸化有机溶剂(有机溶剂调节pH至酸性，以减少花色苷的分解)，在不同条件下进行超声辅助提取桑葚花色苷.用离心机以10 000 r/min离心10 min，取上清液浓缩成浸膏，称重，待用.

1.2.2 花色苷含量的测定

采用pH示差法对桑葚花色苷含量进行测定[9, 13].

pH=1.0的缓冲溶液制备：准确称取1.117 5 g KCl粉末用蒸馏水定容500 mL,用1 mol/L的HCl溶液调节至pH=1.0.

pH=4.5的缓冲溶液制备：准确称取5.4 g乙酸钠粉末，用蒸馏水定容至100 mL，用乙酸溶液调节至pH=4.5.

取0.5 g样品浸膏加一定溶剂稀释成待测样液，取1 mL待测溶液加到9 mL pH 1.0的缓冲液中，分别于520和700 nm处测定吸光值.另取1 mL待测液加到pH 4.5的缓冲液中，分别于520和700 nm处测定吸光值.根据如下公式(1)计算出花色苷含量.

桑葚样品中花色苷含量为：C(mg/L)=A×MW×DF×1000/(ε×l).

(1)

其中A=(A510-A700)pH 1.0-(A510-A700)pH 4.5,(A510-A700)pH 1.0为加pH 1.0缓冲液的样液在510和700 nm波长下的吸光值之差；(A510-A700)pH 4.5为加pH 4.5缓冲液的样液在510和700 nm波长下的吸光值之差；MW=449.2(矢车菊-3-葡萄糖苷的分子量，mg/mol)；DF=样液稀释的倍数；ε=26 900(矢车菊-3-葡萄糖苷的摩尔消光系数，mol-1)；l=比色皿的光路直径，为1 cm.

1.2.3 桑葚花色苷提取工艺的优化

1)单因素试验.分别考察溶剂种类(水、70%甲醇、70%乙醇、70%丙酮)，pH值(pH=1、2 、3 、4 、5)；甲醇体积分数(50%、60%、70%、80%)；料液比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60(g/mL))；提取时间(30、60、90 min)；提取次数(1、2、3)对桑葚花色苷提取率的影响.

2)正交试验.在单因素试验结果基础上，通过正交试验设计L9(33)对桑葚花色苷提取条件进行进一步优化，设置3因素(甲醇体积分数A、料液比B和提取时间C)，每个因素设3个水平，重复3次，具体见表1.

表1 正交实验因素水平表

1.2.4 大孔树脂筛选

参考文献[14-15]，大孔树脂用无水乙醇进行洗涤，并不断搅拌，以除去气泡，充分溶胀，静置24 h后，用蒸馏水清洗到无醇味待用.

1)桑葚粗提液的制备.利用正交实验最佳提取工艺条件对桑葚花色苷进行提取，即称取一定量的桑葚粉末，在pH=1.0的条件下，用70%甲醇，料液比1∶55(g/mL)，超声提取60 min，得到桑葚花色苷的粗提液.

2)静态吸附与解析.准确量取经预处理过的大孔树脂2.000 g，置于三角瓶中，准确加入一定体积的粗提液，室温下中速振荡24 h，至吸附平衡.将吸附平衡的树脂置于具塞三角瓶中，准确加入一定体积的70%乙醇溶液，室温下中速振荡24 h，然后将树脂滤出，分别测定两者洗脱液中桑葚多酚及花色苷的浓度.按(2)式计算吸附量、吸附率和解吸率：

Q=(C0-C1)V1/W,A=[(C0-1)/C0]×100%,D=[(C0-1)V1/C2V2]×100%.

(2)

式中：Q为吸附量(mg/g)，C0为起始浓度(mg/mL)，C1为平衡浓度(mg/mL)，V1为吸附液体积(mL)，W为树脂重量(g)，A为吸附率(5%)，D为解吸率，C2为洗脱液浓度(mg/mL)，V2为洗脱液体积.

1.2.5 抗氧化能力的测定

1)DPPH·清除能力的测定.参照文献[16-17]，略作改动.取0.5 mL不同浓度的纯化前后样品溶液和2.0 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液混合，摇匀，避光反应30 min后，以无水乙醇为空白，于517 nm波长处测吸光度.以对DPPH·的清除率达50%时(IC50，mg/mL)所需要的样品质量浓度来比较不同溶剂提取液对DPPH·清除能力的大小.DPPH·清除率按公式(3)计算.

(3)

其中：T0空白对照组吸光值(0.5 mL甲醇 + 2.0 mL DPPH工作液);Tx0样品对照组吸光值(0.5 mL样品 + 2.0 mL甲醇);Tx样品吸光值(0.5 mL样品 + 2.0 mL DPPH工作液).

2)ABTS+·清除能力的测定.参照文献[18-19]，略作改动.将5 mL 7 mmol/L ABTS溶液和88 μL 40 mmol/L过硫酸钾溶液混合，置于暗处反应12 h，得到ABTS+·储备液，用无水乙醇将ABTS+·溶液稀释使其在734 nm波长条件下的吸光度为0.70±0.02.将0.5 mL不同浓度的纯化前后桑葚花色苷提取物溶液与4 mL ABTS+·溶液中均匀混合，水浴6 min后，于734 nm波长处测其吸光值.按如下公式(4)进行计算.

(4)

其中：X0空白对照组吸光值(：0.5 mL乙醇+ 4.0 mL ABTS工作液);X1样品对照组吸光值(：0.5 mL样品+ 4.0 mL乙醇);X2样品吸光值(：0.5 mL样品+ 4.0 mL ABTS工作液).

3)铁离子还原力的测定.参照文献[19-20]，略作改动.取0.5 mL稀释成不同浓度梯度的纯化前后的样品于5 mL离心管中，加入4.5 mL预热的FRAP溶液(将300 mmol/L pH 3.6醋酸缓冲液、10 mmol/L TPTZ溶液和20 mmol/L FeCl3溶液按10∶1∶1的比例混合，30 ℃水浴10 min备用)，充分混匀后，30℃水浴10 min，在593 nm处测定吸光值(用0.5 mL甲醇进行调零).

1.3 数据处理与统计分析

每组实验均重复3 次，结果表示为均值±方差，采用Origin 8.5绘图软件绘图，SPSS 17.0对数据进行统计学分析，并进行Duncans差异分析，P<0.05表示差异显著.

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

图a所示，用70%甲醇、70%乙醇、70%丙酮以及水按1∶30(g/mL)的料液比分别在同一条件下提取30 min后，按照1.2.2的方法测定花色苷提取率.结果显示提取效果由好到差依次是70%甲醇>水>70%乙醇>70%丙酮.故选择提取溶剂为70%甲醇.

图b所示，用50%、60%、70%、80%、90%甲醇按1∶30(g/mL)料液比在相同条件下提取30 min，计算得桑葚花色苷提取率，结果显示当甲醇体积分数从50%上升到70%时，花色苷提取率逐渐增大，当甲醇体积分数大于70%时，提取效率略微下降，这可能与花色苷极性大小有关系.因此选择最适提取溶剂为70%甲醇.

图c所示，用70%甲醇按料液比1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70(g/mL)在同一条件下进行提取，结果显示随着料液比的增加，花色苷提取率在不断增大，当料液比达到1∶60时，提取率达到最大值，再增加料液比时，花色苷提取率降低.因此从提取效果和经济条件综合考虑，最适料液比为1∶60(g/mL).

图d所示，同时用70%甲醇按料液比1∶60(g/mL)在同一条件下分别超声提取30、60、90 min，结果显示超声时间在30～60 min内，多酚提取率逐渐增大，但超过60 min后多酚提取率略有降低，可能因为提取时间过长导致温度升高，破坏了花色苷的分子结构，从而引起花色苷得率下降[21].因此，最适超声时间为60 min.

图e所示，分别用pH=1.0、2.0、3.0、4.0、5.0的70%甲醇下，以料液比为1∶60(g/mL)进行超声提取60 min得到的桑葚花色苷提取率.结果显示，在pH=1.0的条件下桑葚花色苷提取率达到最大值，而pH逐渐增大提取率呈现减小性的波动.可能的原因是花色苷本身不稳定，在一般条件下极易分解，因此最适pH宜选pH=1.0.

2.2 正交实验结果

正交试验设计及结果见下表2，方差分析见表3.

表2 花色苷正交试验设计L9(33)结果直观分析

表3 正交试验方差分析

注：查表得F0.05(2,4)=4.46，F0.01(2,4)=8.65; 当F比>F0.01时，有极显著差异，用**表示；当F比>F0.05时，有显著性差异，用*表示.

由极差结果分析可知RB>RC>RA，因此影响桑葚花色苷提取率的主次因素为料液比>提取时间>甲醇体积分数.各因素对于提取效率来说没有显著性差异，综合指标最优组合是A2B1C2，即在固定超声波的条件下，桑葚花色苷最佳提取工艺条件为70%甲醇、料液比1∶55(g/mL)、提取时间60 min，该条件下桑葚多酚提取率为6.497%.

2.3 大孔树脂纯化

花色苷吸附量与树脂极性、树脂比表面积有关.大孔树脂对桑葚花色苷的吸附不仅是利用多孔网状结构及高比表面积形成的分子筛作用，而且与树脂和花色苷物质之间的范德华力或氢键有关，树脂的孔径对花色苷的吸附效果影响较大，孔径过小或过大都不利于花色苷分子的保留[22].由以上数据可知，NKA-2型大孔树脂有最好的吸附能力，其次依次为LSD-296>NKA-9>HPD-750>HPD-400，而AB-8型树脂对样品的吸附作用不强，吸附率仅为35.61%，而从吸附样品的解析情况，其解析率大小依次为AB-8>HPD-400>NKA-9>HPD-750>NKA-2> LSD-296.综合考虑吸附和解吸效率两个指标，选取各项指标相对较高的NKA-9型大孔树脂纯化桑葚花色苷.

纯化前桑葚花色苷的含量为6.49 mg/g，纯化后样品的花色苷含量达到10.38 mg/g，说明NKA-9型树脂纯化桑葚花色苷工艺效果较为明显，有一定的实用性，具体结果如下图所示.

2.4 纯化前后抗氧化结果

桑葚花色苷纯化对Fe3+还原力、DPPH·和ABTS+·的清除活性情况如下表4所示.

抗氧化活性的测定具有多种机制，如清除活性氧、抑制脂质氧化等，同一种样品中会有多种抗氧化物质同时存在，在一定程度上会出现协同抗氧化作用.抗氧化活性受多种因素影响，因此，对于同一个样品，应采用3种及其以上抗氧化方法综合评价抗氧化活性[23].本文采用DPPH·、ABTS+·的清除能力以及对Fe3+还原能力的测定3种方法来评价桑葚花色苷纯化前后抗氧化活性的变化情况.

表4 粗提物和纯化后桑葚花色苷提取物对Fe3+还原力、DPPH·和ABTS+·的半抑制质量浓度

结果以IC50值来表示.IC50越小，抗氧化剂清除自由基的能力越强[24].由表4可知，桑葚花色苷具有一定的抗氧化能力，且经大孔树脂纯化后的花色苷由于除去对自由基没有清除作用的糖类、蛋白质和部分有机物使得抗氧化能力明显高于纯化前桑葚花色苷，纯化前花色苷对于Fe3+还原能力、DPPH+·、ABTS+·自由基的IC50分别为0.825、0.318、0.817 mg/mL，而纯化后桑葚花色苷对于Fe3+还原能力IC50值为0.126 mg/mL，比纯化前提高了6.55倍，DPPH+·自由基清除能力提高了1.94倍，而ABTS+·自由基相对于纯化前提高了3.54倍.但相对于抗坏血酸(IC50值分别为0.012、0.012、0.018 mg/mL)来说，桑葚花色苷的抗氧化性能略逊，但作为一种天然抗氧化剂，桑葚提取物均具有良好的自由基清除活性，可作为良好的抗氧化剂来源.

3 结语

本研究采用正交试验考察提取溶剂体积分数、料液比以及时间对桑葚花色苷提取率的影响，确定其最佳提取工艺参数为70%甲醇、料液比1∶55(g/mL)、提取时间60 min，该条件下桑葚花色苷提取率为6.497%.通过6中不同极性大孔树脂吸附和解析效率比较，确定NKA-9 型树脂为桑葚花色苷的最佳纯化树脂.综合DPPH+·、ABTS+·自由基清除活性以及FRAP法对桑葚花色苷提取物的抗氧化活性进行评价，发现其抗氧化活性明显，可作为良好的天然抗氧化剂来源.为桑葚作为天然抗氧化剂的提取和开发利用提供理论基础.