区分牛羊布病免疫抗体与感染抗体的技术应用

任宇斓，于厚军

（新疆生产建设兵团第三师畜牧兽医站，新疆 图木舒克 844000）

布病是由布氏杆菌引起的以流产和发热为特征的一种人畜共患传染病，人感染布氏杆菌后，需要长时间的抗生素治疗，而且往往会留下严重的后遗症。属于我国规定的二类动物疫病，该病直接影响牛羊生产效益，并危害人类健康，《国家中长期动物疫病防治规划（2012-2020）》将其列为二类动物疫病优先防治病种之首，因此消除布病一直是公共健康计划中最重要的目标之一。

2008年以前，我师认真贯彻“以免疫为主的综合防治”方针，坚持结合检疫隔离、淘汰、扑杀等措施，对布病的防控起到一定的作用，直至2012年，全师布病阳性检出率在0.03%以下。但近几年，据师布病监测报表显示显示布病阳性数不是梯次减少，而是出现反弹现象。布病防控又被提上议程。

根据国家及兵团《中长期动物疫病防治规划（2012-2020）》目标及要求，按照兵团及师制定的《畜间布病防控实施方案》，全师于2016～2018年开展牛、羊布病全面免疫。但是存在的问题是如何区分牛、羊布氏菌自然感染抗体和菌苗免疫抗体，成为布病防控的难题之一。因为布氏菌苗免疫以后所产生的各种血清学反应和自然感染所产生的血清学反应极其相似，若不加以甄别，可能导致感染阳性畜鱼目混珠，针对这一问题，笔者于2016年度对我师牛、羊布病抗体进行了长期监测与分析，并采用多种检测方法对比和重复对免疫抗体和感染抗体进行甄别和鉴定。为三师布病防控与净化做好前期工作，为主管部门提供决策依据，同时，为维护动物食品安全和公共卫生安全提供保障。

家畜布病的检查主要有两个方面，细菌学检查和血清学检查，前者是最可靠的手段，但因耗时长，常受技术、设备等限制，难以常规实施；血清学诊断也是检查布病的主要方法，目前我国布病的血清学诊断主要使用虎红平板凝集试验，试管凝集试验和补体结合试验等。

1 免疫前检疫工作

发动全师各农牧团场兽医骨干队伍，对全师牛、羊采样，利用常规平板凝集试验进行全群检疫，此项工作由于工作量大，对工作环境及人员防护具有一定的要求，因此执行过程中先由各团场兽医进行了全群采样和虎红平板凝集试验初筛，对初筛阳性样品，送师站由课题组成员复检，对复检阳性反应的，及时反馈养殖场户并对阳性样品对应畜进行强制隔离扑杀。如果此项检疫工作不扎实，不彻底将会增加免疫抗体与感染抗体的甄别困难。免疫前检疫阳性结果（见表1）。

此次检疫共检样品360666份，其中牛10558份，无阳性样品，羊350108份，虎红平板凝集试验初筛阳性数1620份，阳性率为0.46%；试管凝集实验复检阳性数1110份，阳性率为0.32%。热敏感试验验证免疫抗体阳性样品数为1110份，排除了免疫阳性的可能。补体结合试验验证感染抗体阳性样品1110份，与试管凝集试验复检阳性数吻合。最终确定1110份阳性样品均属感染阳性，隔离扑杀羊只1110只。

2 全面免疫

依据兵团第三师畜间布病防控实施方案，严格按照疫苗使用说明书进行操作，全师使用疫苗为羊型M5号弱毒活菌苗。该菌苗毒力比较强，很稳定，对牛、羊布鲁菌均具有免疫力和保护力，此菌株作为疫苗尚有一定的毒性，而且在一定的条件下毒力可恢复，因此在免疫接种期间要严格做好个人防护和操作后消毒工作。免疫接种由各单位基层兽医具体实施，课题组成员负责做好防护培训及技术指导。免疫前师站组织召开了布病免疫培训班，为全面免疫工作提供技术和保障。

3 免疫抗体与感染抗体鉴别技术

3.1 原理

根据免疫学理论无论是布氏杆菌自然感染或是人工免疫，经过一定时间机体产生各种类型的抗体或不同类别的特异性免疫球蛋白，动物血清中首先开始形成的是IgM抗体，以后IgG抗体逐渐增加，并达到很高的水平能够保持整个感染过程，在感染动物体中主要存在的是IgG抗体，含量高，持续时间长，也有一定量的IgM出现；而免疫机体中主要出现IgM抗体，而IgG抗体滴度低。而免疫动物体主要存在的是IgM类抗体。鉴于自然感染和菌苗免疫后产生的特异性抗体IgG、IgM具有量的差别而且还有时相的差异。

研究表明人及动物接种布病疫苗后，大约5d产生 IgM抗体，2周后可达高峰；而IgG抗体在4周左右达高峰，以后逐渐下降；而人及动物感染后数日出现IgM和IgG杭体，且IgM抗体很快下降，lgG抗体的高峰期可维持720d，1年后仍可维持在诊断水平，因此血清抗体IgG的存在乃是慢性布病感染过程的重要指征。特异性杭体IgG的测定具有重要临床诊断意义，也是区别免疫接种和自然感染抗体的重要指标。由于CFT（补体结合试验）所查的主要是lgG类抗体，因此CFT常用于布病疫苗免疫和自然感染抗体的鉴别诊断。

另外，IgM对热是不稳定的，加热56℃就发生变性。随温度的升高变性加剧。65℃15min几乎所有IgM都被破坏，故提高反应温度可抑制大分子抗体的凝集作用。试验时，被检血清按常规试管凝集法稀释，先在62℃～64℃水浴中灭活30min，然后按常规加入抗原，放在温箱中培养和观察结果，自然感染的血清呈阳性反映，而人工免疫的血样则基本上呈阴，这也是区别免疫抗体和自然感染抗体的重要指标。

3.2 定点采样抽检监测及结果

选择免疫接种15～35d的牛、羊养殖点，按比例采样抽检血液样品共计3000份次，其中牛血样500份，羊血样2500份。所采样品先用虎红平板凝集试验进行阳性初筛，再同步进行试管凝集和热变性试验，因为热变性试验的基础试验为试管凝集，只是试验温度不同。热变性试验也是免疫阳性抗体的验证试验。为确保试验结果的准确率，检测还同步进行了感染阳性的验证即补体结合试验。

虎红平板凝集试验初筛检测牛477份阳性，阳性率95.4%，羊2417份阳性，阳性率96.7%，试管凝集试验复检牛样品477份均为阳性，羊样品2417份均为阳性。热变性试验检测牛样品477份均为阴性，羊样品2417份均为阴性，据此初步说明试管凝集试验复检的阳性样品均为免疫阳性样品。补体结合试验检测样品牛500份，羊2500份阳性数为零，据此说明所采牛、羊共计3000份样品无布病感染阳性。同时进一步验证了试管凝集试验复检的阳性样品均为免疫阳性。免疫抗体和感染抗体鉴别结果（见表2）。

表1 免疫前检疫阳性结果

表2 免疫抗体和感染抗体鉴别结果

4 分析与讨论

4.1 免疫前检疫工作需扎实彻底，否则会增加免疫抗体与感染抗体的甄别困难，检疫中进行布病抗体鉴别的意义在于避免误杀免疫外购畜。

4.2 有学者应用利凡诺尔凝集试验与补体结合试验进行了符合率的验证，结果表明补体结合试验与利凡诺尔试验的符合率为85.95%～98.14%，进一步验证了补体结合试验在免疫动物和感染动物的鉴别上的应用价值。本项目未使用利凡诺尔试验的原因是，该试验对实验室生物安全水平有一定的要求，师站生物安全资质有限。

4.3 在免疫抗体和感染抗体鉴别检测结果中未检出感染抗体的原因分析，（1）所选采样点免疫前检疫、隔离、扑杀工作做得比较扎实彻底没有遗漏感染阳性畜；（2）据调查在抽样检测期间，各采样点没有引进外购畜。