芝麻香型白酒酿酒微生物研究进展

王志山，陈文浩，刘 洋*

（1.宜宾学院 固态发酵资源利用四川省重点实验室，四川 宜宾 644000；2.北京科技大学 化学与生物工程学院，北京 100083）

芝麻香型白酒是我国传统白酒的创新香型之一，兼具有浓香型、清香型以及酱香型白酒的特点，是鲁酒的代表香型，以其浓、清、酱相结合的工艺特点和独特的优雅芝麻香味，具有“芳香馥郁，绵软醇厚，香味协调，芝麻香幽雅”的独特风格，符合白酒淡雅、爽净的消费趋势[1-2]。芝麻香型白酒的工艺特点包括高温制曲、高氮配料、高温堆积、高温发酵、多微共酵、分层蒸馏、长期储存以及科学勾兑八部分[3]，主要原料为麸皮、小麦、高粱。就目前来看，国内对于芝麻香型白酒的研究主要集中于其酿造工艺的改进、芝麻香型白酒微生物的多样性分析以及对芝麻香型这种独特香味的成分及产香原理进行分析，其中还有很大一部分是对芝麻香型白酒高温大曲中的酿酒微生物进行的研究，以期从中筛选获得相关功能性菌株用以提升芝麻香型白酒的酿酒效率。本文主要对芝麻香型白酒酿酒微生物的多样性分析、产香味成分分析、酶活性研究以及酿酒微生物在芝麻香型白酒生产中应用的最新研究进展进行了综述，并在此基础上结合自身相关科研实践对芝麻香型白酒酿酒微生物未来的研究与利用提出了思考与展望，以期为后续研究提供帮助与参考。

1 芝麻香型白酒酿酒微生物多样性分析

芝麻香型白酒酿酒微生物在芝麻香型白酒高温大曲、窖池、窖泥以及原料堆积过程中都有广泛分布，不仅对芝麻香型白酒酿酒及风味形成起着决定性作用，还对其品质有着不小的影响。

传统酿酒微生物物种丰富，主要包括酵母菌、细菌、霉菌、乳酸菌等，以酒曲为例，曲块各层次之间在微生物数量、种群以及优势菌群上存在明显差异，而且曲块中微生物总数从上到下呈下降趋势，其中酵母菌在酒曲各层次中分布较少，曲块中心和底部的优势菌种是细菌，表层优势菌种为霉菌[4-5]。芝麻香型白酒酿造过程中也同样存在类似的微生物种类分布，曹润洁等[6]通过分析芝麻香型酒醅堆积过程中微生物结构变化，发现酒醅在高温堆积发酵过程中，原核微生物和真核微生物有着不同的变化规律：若以20 h时的翻堆为结点，则原核微生物在翻堆前的优势菌种是芽孢杆菌属（Bacillus）、醋杆菌属（Acetobacter）和魏斯氏菌属（Weissella），堆积后优势菌种为Acetobacter和Weissella，其中Acetobacter占绝对优势。和原核微生物相比，真核微生物的结构逐步集中，发酵结束时酵母菌占真菌总量的93%以上。唐小丽等[7]采用Biolog微平板鉴定技术对芝麻香型白酒高温大曲制作过程中的微生物群落结构多样性进行了分析探究，从侧面反映了高温大曲在制作过程中的微生物动态演替过程。通过对其微生物代谢强度和多样性指数分析发现，酒曲微生物代谢强度最高、多样性最为丰富的是在发酵第9天，而微生物多样性较差、碳源利用能力最弱是在发酵第12天、第20天及第36天。

高温大曲是利用多种微生物混合自然固态发酵小麦等原料而成，其最高温度可达65 ℃，它也是芝麻香型白酒生产的关键因素之一。高温大曲也为白酒酿造提供了丰富的微生物资源、各种生物酶类以及多种香味前驱物质，在传统白酒酿造过程中发挥着重要的作用[8-11]，所以高温大曲中的生物多样性分析对于芝麻香型白酒酿酒微生物的进一步探究有很重要的作用。但随着制曲以及酿酒温度的提高，大部分不耐温的霉菌和酵母被淘汰，酒曲微生物区系有向繁殖细菌方向转化的趋势，形成以高温细菌为主的特殊微生物群落结构[12]。徐泽江等[13]应用磷脂脂肪酸分析方法研究了芝麻香型白酒堆积过程微生物生物量和群落结构的变化，结果发现细菌是堆积过程中的优势菌群，革兰氏阴性菌是细菌中的优势菌群，在不同的样品中好氧菌和厌氧菌差异也比较大。姚粟等[14]采用构建16S rDNA克隆文库的非培养方法，对我国芝麻香型白酒高温大曲细菌的群落结构及其多样性进行探究，Kroppenstedtia eburnean和普通高温放线菌（Thermoactinomyces vulgaris）首次在高温大曲中被发现，同时还发现了分属于糖丝菌属（Saccharothrix），异壁链霉菌属（Streptoalloteichus）和Pseudofulvi monas的3株潜在的细菌新种。葛媛媛等[15]利用传统培养和高温筛选方法对芝麻香型白酒高温大曲中嗜热细菌群落结构进行了研究，发现在55 ℃高温筛选获得的85株嗜热细菌分属于芽孢杆菌属（Bacillus），高温放线菌属（Thermoactinomyces），链霉菌属（Streptomyces）及施莱格尔氏菌（Schlegelella）4个菌属，其中第1优势菌为普通嗜热放线菌（Thermoactinomyces vulgaris），丰度为69.41%，而且这也是首次对芝麻香型白酒高温大曲中嗜热细菌类群的报道。乳酸菌的群落动态及种类对白酒品质也至关重要，但长期以来，技术水平的局限使得白酒乳酸菌的研究报道较少，目前对于白酒乳酸菌群结构和功能的认识也不清楚。随着芝麻香型白酒酿酒微生物研究的深入，芝麻香型白酒发酵过程中的乳酸菌也被关注。邢敏钰[16]对芝麻香型白酒发酵过程中乳酸菌的多样性进行了探究，发现乳酸菌占到发酵过程中细菌总量83.25%以上，是芝麻香型白酒发酵过程中的优势细菌。而且芝麻香型白酒发酵过程中乳酸菌种类也特别丰富，涉及5个属，包括了乳杆菌属（Lactobacillus）、片球菌属（Pediococcus）、魏斯氏菌属（Weissella）、乳球菌属（Lactococcus）和明串珠菌属（Leuconostoc）等类群在内的43种乳酸菌，并且发现其中的乳酸菌属（Lactobacillus）很有可能是一种新的乳酸菌，其与GenBank中的模式菌株斯瓦比乳杆菌（Lactobacillus suebicus）LC071852.1的相似度最大，却也只有92%。

除了芝麻香型白酒高温大曲，芝麻香型白酒窖池、窖泥等中也存在大量酿酒微生物。宣灵等[17]对宣酒芝麻香型白酒生产过程中的窖池内环境、空气环境以及酒醅发酵进行了全程跟踪取样，结果发现窖池内环境中的酿酒微生物数量中上层明显多于下层，而且细菌总数也明显高于霉菌与酵母菌总和，但空气环境与发酵酒醅、堆积中菌类总数变化规律均为细菌＞酵母菌＞霉菌。除此之外，研究发现在整个发酵过程中，由于窖泥与酒糟之间进行的微生物和物质能量的交换而形成了特殊的酒体微量成分与微生物菌群结构的组成。王海燕等[18]将江苏地区浓香型和芝麻香型白酒酒醅在发酵过程中的微生物菌群结构进行了对比研究，然后将16S rRNA克隆文库的测序结果在数据库中进行比对，结果发现浓香型和芝麻香型酒醅中的微生物种属存在巨大差异，仅有Bacillus、Lactobacillus、Weissella和Acetobacter4个属的微生物均能在两个文库中检测到。而且酒醅中微生物多样性随着发酵时间延长也不断降低，发酵结束时食木薯乳杆菌（Lactobacillus manihotivorans）成为最主要的优势菌种。施安辉等[19]通过对水浒芝麻香型酒窖泥微生物的分布进行初步鉴定时发现，水浒大曲酒窖泥中的优势微生物主要是好氧的芽孢杆菌属（Bacillus）、短杆菌属（Brevibacterium）和乳酸杆菌属（Lactobacillus）和厌氧的丁酸菌属（Butyribacterium），其中酵母菌以球拟酵母属（Torulopsis）、假丝酵母属（Candida）和汉逊氏酵母属（Hansenula）为主。卢振[20]在对芝麻香型白酒窖泥质量的评价研究中利用梭菌纲引物分析窖池泥微生物，所有测序条带的最高相似菌均属于梭菌纲（Clostrida），共11个属，并且综合变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）图谱和菌种测序结果发现，优质窖泥中细菌和梭菌纲微生物多样性和均匀度都比正常窖泥和退化窖泥高，正常窖泥却比退化窖泥高；利用细菌引物分析窖池泥微生物，发现所有测序条带的最高相似菌包括拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes）3个门类，共计21个属，其中优质窖泥中梭菌属（Clostridium）、醋酸菌属（Acetobacter）、假单胞菌属（Pseudomonas）、固氮菌属（Azotobacter）的优势度最高，正常窖泥中魏氏菌属（Weissella）、厌氧分支杆菌属（Anaerobranca）、四体球菌属（Tetragenococcus）、瘤胃菌属（Ruminococci）的优势度最高，退化窖泥中互营单孢菌属（Syntrophomonas）和乳酸菌属（Lactobacillus）的优势度最高。

2 芝麻香型白酒酿酒微生物产香分析

“芝麻香”通常被认为是芝麻香型白酒的代名词，芝麻香型白酒是中国成立后两大创新香型之一（芝麻香型白酒与兼香型）。芝麻香型白酒是以芝麻香为主体，兼具浓香、清香、酱香三种香型之所长，是中国“十一大香型”中最年轻的一个成员，同时它也是酿造条件要求最高，酿造技术难度最大，对环境要求最严格的一个香型，堪称白酒中的贵族香型，因此对芝麻香型白酒的产香微生物及其中的成分探究对于芝麻香型白酒的酿酒技术改进有重要意义。

由于芝麻香型白酒酿造的模式是采用大麸结合多微生物协同发酵，因此芝麻香香味成分相对复杂，主体香是在醛、酸、醇、酯达到一定比例后再辅以吡嗪类、酚类、呋喃类等杂环化合物及含硫化合物而形成的复合香味[21]。

山东省第一轻工业科学研究所在1982年研究成果中发现在以景芝白干为代表的芝麻香型白酒中含量比较高的成分是β-苯乙醇、丁二酸二乙酯和四甲基吡嗪，虽然四甲基吡嗪含量不高，但其在雅淡的芝麻香型白酒中所起的作用是不可忽视的。朱双良等[22]对梅兰春芝麻香型酒微量成分的检测结果进行了分析，结果发现梅兰春酒不仅含有多种有机酸和脂肪酸（酯）、醇类、吡嗪类、酚类化合物等成分，而且还具有芝麻香型白酒独有的风味成分。张媛媛等[23]对扳倒井芝麻香型白酒中香味成分进行了检测，发现其中除了含有二甲基二硫醚、3-甲硫基丙醛及甲基甲烷硫代磺酸酯，还含有二甲基四硫醚、糠硫醇、二糠基二硫醚、二异丙基二硫和二甲基硫代亚磺酸酯等香味成分，这些香味成分是首次在芝麻香型白酒中被检测到。郑杨等[24]也对扳倒井芝麻香型白酒香味成分进行了分析，结果鉴定出包括2-羟基丙酸乙酯（15.72%）、3-甲基-1-丁醇（11.20%）、乙酸（8.94%）、己酸乙酯（4.77%）、糠醛（4.17%）等在内的含量相对较高的挥发性成分共179种，经鉴定其中有54种酯类、51种烃类、20种酸类、19种醇类、17种芳香族化合物、7种呋喃类、7种醛类、4种酮类。

研究人员通过探究发现，大量菌株在芝麻香型白酒酿造过程中对其独特风味形成起到了很大的作用。袁超[25]分析探究了芝麻香型白酒酿造过程中细菌、霉菌、酵母菌等关键微生物的总量及其相关功能，结果发现样品中的酵母菌、霉菌以及细菌对芝麻香型白酒香气形成与积累有很大的影响，并且结合芝麻香型白酒酿造堆积过程与发酵过程中原料中的游离氨基酸、还原糖及主要酯类、有机酸的积累变化规律、糖化酶活力、酸性蛋白酶活力和淀粉含量的变化规律等各项理化指标对芝麻香型白酒生产过程中不同微生物菌群的作用进行了初步阐述。

在众多的酿酒菌种中，芽孢杆菌对于芝麻香型白酒风味的形成有很重要的作用。吕磊等[26]用富含α-氨基酸态氮及还原糖的基础培养基进行枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）的单菌种发酵，通过检测发现枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）能够产生正戊醇、乙偶姻、2,3-丁二醇等物质，地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）能够产生苯乙醇、四甲基吡嗪及一些高级脂肪酸酯，这些成分不仅能够极大的丰富芝麻香型白酒的香气组成、赋予芝麻香型白酒特殊的香气风味，还有益于人体健康。陈向田[27]从芝麻香型酿造酒醅中筛选得到了5株产香气物质较强的细菌，经鉴定全部为芽孢杆菌，并将这5株菌进行扩大培养，应用到传统芝麻香型白酒酿造工艺中，用于调味酒生产。通过对调味酒的感官对比与色谱分析发现：经功能细菌强化的芝麻香型白酒的原有风格得到了显著提高，芝麻香型白酒独特风味物质的形成机理也得以体现。

3 芝麻香型白酒酿酒微生物酶活探究

白酒的酿造过程是利用酿酒微生物产生的各种酶，分解原料中的淀粉、纤维素、蛋白质、脂肪等大分子物质，在产生酒精的同时也生成其他香味物质，芝麻香型白酒的酿造亦是如此，其中的酶包括蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶及糖化酶等，而且这些酶或多或少都在酿酒过程中起到决定性作用。

徐泽江[28]研究发现，芝麻香型白酒酒曲中存在葡萄球菌属（Staphylococcus）、约翰不动杆菌（Actinotobacter johnsonii）、琼氏不动杆菌（Actinotobacter junii）以及片球菌（Pediococcus）等，其中片球菌能在高温、低pH和高酒精度条件下生长，葡萄球菌属主要分解原料中的蛋白质和脂肪。李季鹏[29]以淀粉酶、蛋白酶等酶在芝麻香型白酒高温大曲、麸曲中的分布情况入手，得到了大曲、河内白曲水解酶系的酶活力，发现虽然麸曲产蛋白酶活力不足，但是补充了一株高产酸性蛋白酶的菌株黑曲霉（Aspergillus）M-002到麸曲中之后，酒的出品率、风味等都有明显提高。酸类物质及酯类物质是芝麻香型白酒中重要的香味物质[30]，脂肪酶正是发酵过程中分解产生此类香味物质的酶，翟磊等[31]采用纯培养技术和改进的罗丹明平板法，对山东扳倒井高温大曲不同发酵阶段的大曲样品中产脂肪酶的微生物进行了筛选与鉴定，结果共筛选得到15株产脂肪酶菌株，又通过活力测定得到6株产脂肪酶活性较高的菌株，并对这些菌株进行了分子生物学及形态学的鉴定。李小东等[32]通过研究酒醅蛋白水解率对芝麻香型白酒发酵过程及原酒品质的影响时发现，高蛋白水解率主要通过催化酵母、芽孢杆菌、细菌的微生物协同代谢作用和美拉德反应的发生来影响发酵的最终理化结果，而且高蛋白水解率能够提高风味物质的种类和含量，尤其显著提高了吡嗪类物质的含量，也能够加强原酒品质及堆积发酵过程中焦糊香放香效果、提高酚类物质浓度及促进吡啶类物质的产生。大曲是酿酒过程中酿酒微生物的主要富集场所，本课题组也对芝麻香型白酒高温大曲中的微生物进行了筛选，得到一株既明显产淀粉酶又明显产蛋白酶的菌株Q2B1，并且通过初步鉴定确认为芽孢杆菌属（Bacillus）。由此可见，芝麻香型白酒和大部分传统白酒一样，酿酒微生物代谢产生的淀粉酶、蛋白酶及脂肪酶等对其酿造起到了决定性作用。

4 酿酒微生物在芝麻香型白酒生产中的应用

利用不同的酿酒工艺、酿酒原料和酿酒微生物，可以酿造出各种不同口味和香型的白酒，故芝麻香型白酒的生产工艺改进方法、芝麻香型白酒酿造原料的选择方法和芝麻香型白酒酿酒微生物的选择方法等对芝麻香型白酒的酿酒工艺提升有很大的帮助[33]，其中酿酒微生物的选择方法是最高效的又节省成本的方法之一。

目前最常用的方法就是从不同的高温大曲中去筛选得到高产相关酶的菌种，然后通过扩大培养制成菌液用在芝麻香型白酒的生产过程中，这种方法最大的好处就在于目的性明确，可行性也比较强，但需要对芝麻香型白酒的酿造及产香机理很清楚才能准确的去筛选得到高效提升芝麻香型白酒产量及品质的菌株，而且从菌种的筛选到投入生产耗时较长。

随着航天事业的发展与长足进步，近些年对于酿酒微生物太空育种在芝麻香型白酒生产中的应用也取得了很大的进步。2014年，张彬等[34]将芝麻香型白酒生产中的酵母菌、芽孢杆菌及河内白曲等主要功能酿酒微生物经“神舟八号”飞船搭载进行太空诱变育种，结果发现酵母菌的产酯能力、芽孢杆菌的蛋白酶活性及河内白曲的糖化酶活性均得到明显的提高。2015年，张彬等[35]又在前年基础上将太空诱变育种后的酵母菌、芽孢杆菌及河内白曲应用于芝麻香型白酒生产，结果表明，太空诱变后的菌株不仅可以减少发酵过程中的用曲量，缩短发酵周期，还可以明显提升产品的质量。虽然太空育种对酿酒微生物的产酶活力等有显著提高，但对于太空育种的弊端也同样要引起研究人员重视，因为利用辐射使酿酒微生物基因产生有利突变的同时也极有可能会产生一些常规手段检测不出来的致病或产毒素的基因突变，如果这些不利突变酿酒微生物运用于芝麻香型白酒生产，可能会严重威胁消费人员的生命健康，同时也会极大的影响芝麻香型白酒的声誉。

5 前景与展望

芝麻香型作为我国的创新香型之一，想要获得大众认可，就必须努力改进和提升相关芝麻香型白酒企业的酿酒效率，建立属于芝麻香型白酒自己的一套安全评价机制以及菌种资源库。近十年来芝麻香型白酒酿酒微生物的多样性分析、产香分析、酶活分析、酿酒微生物在芝麻香型白酒的生产应用等方面都取得了很大的进步。目前对于芝麻香型白酒酿酒微生物的研究还处于相关产酶菌株的筛选及其代谢产物对于芝麻香型这种独特风味的影响阶段，想要真正做到相关酿酒企业的全面升级改造、芝麻香型白酒酿酒工艺的大力提升以及芝麻香型白酒安全评价机制、菌株资源库的建立，还需要研究人员做出很大的努力。随着现代生物技术的大力发展，对于芝麻香型白酒酿酒微生物的探究还存在很多方面的问题，例如是否可以实现芝麻香型白酒纯菌种酿造产业化，打破传统酿酒过程中多菌种的酿造形式，使筛选得到的高效菌得到最大化利用？是否可以利用筛选得到的高效菌获得芝麻香型白酒酿酒酶制剂，进而提升白酒行业的全面升级改造？是否可以利用已有的及后续的研究成果建立一套白酒产业的安全评价机制，做到真正的安全生产、健康饮用？或者也可以开展芝麻香在香型融合方面应用研究，以此发挥芝麻香型白酒与其他香型白酒融合方面的作用与功能等等。