铁在不同磷源条件下对铜绿微囊藻生长与产毒的影响

王 举，陈 荣，陈 静，沈 莹

(西安建筑科技大学环境与市政工程学院，陕西西安 710055)

水体富营养化现象日益严重，已经成为全球面临的水污染问题之一。水体富营养化过程中蓝藻属的微囊藻是最为常见的一种有害藻种[1]，其繁殖速度快、易在富营养化水体中大量生长且伴随有藻毒素的产生危害人体健康。以往研究发现氮磷等营养物质超标是引发水体富营养化问题的重要原因[2]，然而在降低了氮磷浓度的自然水体中水华现象的爆发仍然屡见不鲜[3]。自然水体中磷主要以可溶性有机磷和悬浮态磷的形式存在，生物可直接利用的可溶性无机磷的含量很低，往往不能满足藻细胞对磷的需求[4]。在湖泊蓝藻水华形成的初期，可溶性无机磷含量往往不足，溶解性有机磷将会作为补充磷源，促进水华蓝藻的生长[5-6]，因此藻类对有机磷的利用逐渐引起人们的关注[7-8]。随着研究的深入，发现微量金属元素也会成为藻类生长的关键影响因素[9]。铁(Fe)作为藻类生长发育所必需的主要微量营养元素之一，在光合作用、呼吸作用、固氮作用、蛋白质与核酸合成等生理代谢过程的电子传递以及酶促反应中发挥着极为重要的作用[10-11]，同时铁元素能够影响藻毒素的形成。以往研究中以铁元素单独作用或者铁与磷共同作用对藻类生长与产毒影响的研究较多[9]，而对有机磷与铁共同作用的探讨稍显不足。本文探讨微囊藻在不同磷源利用过程中铁元素的作用特性，研究铁与磷的共同作用对藻细胞生长与产毒的影响，为抑制蓝藻暴发、解决水体富营养问题提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用藻种为产毒铜绿微囊藻 (Microcystis aeruginosa)，购置于中国科学院水生生物研究所，藻种编号为FACHB-912。采用BG-11培养基在恒温光照培养箱中培养，培养温度为(25±1)℃，光照为3000 lx，光暗时间分配为 12 h∶12 h。

实际水体中有机磷化合物的形态非常复杂，人们对其具体的组分和比例知之甚少[12]，通常认为碱性磷酸酶可以水解一些小分子有机磷和部分大分子有机磷，因此以小分子有机磷和大分子有机磷的研究较多[13-14]。本研究选择3种具有代表性的磷：无机磷磷酸氢二钾(K2HPO4)，小分子有机磷甘油磷酸钠(C3H7Na2O6P·5．5H2O，简写为NaGly)和大分子有机磷卵磷脂(C40H82NO9P，简写为LEC)，试验药品均为国产科密欧分析纯试剂。

1.2 培养基设置

培养基除氮、磷、铁元素外，其他均依照BG-11的营养条件来设置。为保证培养基中各营养盐浓度恒定，先按照BG-11培养基配方配置原液，然后按比例取一定体积原液混合后灭菌，再分别加入灭菌后的氮、磷、铁配置液，最后用经过灭菌的超纯水定容至500mL。由于再生水补水已经成为当前城市景观水体补水的重要方式，因此氮浓度设置依据GB 18918—2002《城镇污水处理厂污染物排放标准》中Ⅰ级A排放标准来设定(ρ(TN)≤15 mg/L)，试验中以NaNO3为氮源设置硝氮质量浓度为10mg/L，分别以3种不同形态磷为磷源，总磷质量浓度设置为0．1 mg/L。铁元素用柠檬酸铁铵配置，在本研究对西安市城市景观水体的调研中发现，其中微量元素铁的质量浓度相对较高，从几十至几百μg/L，在实验室研究中发现高磷条件下铁最佳作用浓度范围为500～1000 μg/L，设置 3 个浓度梯度，分别为50 μg/L、500 μg/L 和 1000 μg/L。

1.3 饥饿及接种

将正常培养至对数期的藻种在25℃、6000 r/min条件下离心10 min，去掉上清液后用15 mg/L的NaHCO3洗涤3次后保留离心得到的藻细胞，接种至饥饿处理的培养基(不含氮、磷、铁元素)预培养7 d。预培养结束后按上述方法再次离心只留下藻细胞后，接入配置不同铁浓度梯度培养基中，接种初始藻密度约为2×105个/mL，初始培养时培养液总体积为500 mL，培养瓶是总容积为1000 mL的广口锥形瓶。接种好的培养瓶置于设置好的培养箱中培养，为确保试验准确，每个样品设3个平行样，每天手动摇3～4次，并将各培养瓶随机放置，以减少光强对藻类生长的影响。

1.4 指标测定

1．4．1 藻密度、藻细胞平均粒径及增长率

藻密度及藻细胞平均粒径的测定采用细胞计数分析仪(Cellometer Auto T4，达科为，中国)，每次测定取样量为1 mL。试验过程中，从接种至结束每隔1 d测定1次藻密度。藻细胞比增长率计算公式为

式中：Xt为某一时间间隔终结时的藻细胞数量;X0为某一时间间隔开始时的藻细胞数量;t为时间间隔。当连续2 d的μ小于5%时即认为藻细胞停止生长。

1．4．2 叶绿素 a 的测定

叶绿素a的测定采用乙醇提取法，每2d测定一次，每次取10 mL藻液。将取出的藻液加入适量饱和碳酸镁混匀后经真空抽滤装置抽滤，将滤纸用剪刀剪碎后加入5 mL体积分数为90%的乙醇，置于4℃冰箱中，黑暗提取8～12 h，离心后取上清液经分光光度计测定。

1．4．3 藻细胞中溶解性总磷浓度

取一定量的藻液，6000 r/min离心10 min，弃上清液留下藻细胞加入5 mL超纯水，经5%过硫酸钾消解后，以抗坏血酸为还原剂采用磷钼蓝比色法进行测定。

1．4．4 碱性磷酸酶活性

碱性磷酸酶活性(alkalinephosphatase activity，APA)与水体富营养化程度呈正相关，当溶解性无机磷含量很低时碱性磷酸酶才会被激活，高浓度的溶解性无机磷对APA几乎无影响，因此APA的检测有助于分析藻细胞对磷源的吸收转化状况[15-16]。

取5 mL藻样，加入已经灭菌的比色管中，随后加入1mL Tris-HCl缓冲液(pH值8．5)，摇匀后加入1 mL反应底物对硝基苯磷酸二钠(p-Nitrophenyl phosphate，PNP-P)。将比色管避光处理放在30℃的生化培养箱中，反应6 h，用1 mL的0．5 mol/L的NaOH溶液来终止反应。用紫外分光光度计在410 nm处测定反应产物对硝基苯酚(p-Nitrophenol，PNP)的产生量，并计算单位时间所产生的PNP，并以此作为细胞APA的单位。

1．4．5 胞内藻毒素(MC-LR)

标准藻毒素样品(纯度98%)购置于Sigma，按GB/T 20466—2006《水中微囊藻毒素的测定》中藻毒素的测定方法测定，采用液相色谱装置测定(LC-2000，日立，日本)藻毒素含量，分离柱尺寸为250 mm ×4．6 mm(SB-C18，安捷伦，美国)。 从培养第2天开始每隔1天测定一次藻细胞藻毒素含量，第2天藻液取样量为15 mL，以后每次为10 mL，样品的制备参考Long[17]的制备方法。

1.5 数据分析

所有试验数据均采用Excel 2010处理，采用Origin9．1绘图，数据统计分析采用 SPSS20．0，P 值表明各组数据之间是否存在显著性差异，P＜0．05有显著性差异，P＞0．05无显著性差异。

2 结果与讨论

2.1 藻细胞生长状况

2．1．1 不同磷源对藻细胞生长的影响

图1～3为不同磷源条件下铜绿微囊藻的细胞密度、叶绿素a质量浓度和细胞平均粒径变化情况。由图1～3可以看出，以K2HPO4与NaGly为磷源时，藻细胞生物量间并无显著性差异，而以LEC为磷源时存在显著性差异(P＜0．05)。以K2HPO4为磷源时藻细胞的平均粒径变化较为平缓，波动性不大;以NaGly为磷源时藻细胞平均粒径有较小波动;而以LEC为磷源时藻细胞的平均粒径波动性较大。即在K2HPO4与NaGly为磷源的条件下藻细胞的生存状态更为稳定，磷源越容易被利用越有利于藻细胞的生长。以K2HPO4与NaGly为磷源时，在培养期间藻细胞数量都在不断增加，最大藻细胞数量分别可达到6．02 ×106个/mL 和 6．43 ×106个/mL，而以 LEC为磷源时，在整个培养期间藻细胞数量只有少量增长。以往研究中发现正磷酸盐是最易吸收和利用的一种磷源，而小分子有机磷和大分子有机磷都需经过诸如碱性磷酸酶等水解转化为磷酸盐后方可被利用，并且小分子有机磷比大分子有机磷更容易转化为磷酸盐。但本研究发现K2HPO4与NaGly对藻细胞生长的作用并无显著性差异，而只与LEC之间存在显著性差异，即藻类在吸收磷时，藻细胞对K2HPO4和NaGly的利用效率较高，而对LEC的利用率较低。从图2叶绿素a浓度的变化趋势可以看出，在以K2HPO4与NaGly为磷源时，叶绿素a质量浓度与藻细胞生物量的变化趋势基本一致，经相关性分析发现二者之间显著相关，而在以LEC为磷源时叶绿素a质量浓度与藻细胞生物量间相关性较差。

图1 不同磷源下铜绿微囊藻细胞密度

图2 不同磷源下铜绿微囊藻叶绿素a质量浓度

图3 不同磷源下铜绿微囊藻细胞平均粒径

K2HPO4与NaGly对藻细胞生长(藻细胞数量与叶绿素a浓度)的影响并无显著性差异，其主要原因可能与微量元素铁相关，K2HPO4可以被藻细胞直接吸收利用，而微量元素铁促进了NaGly的吸收，使其更有利于藻细胞的生长。微量元素铁对LEC虽也有促进作用，但由于LEC较难被水解，因此促进效果并没有对NaGly的作用显著。以K2HPO4为磷源时，不同含量的铁对藻细胞生长的影响不同，随着铁含量的增加藻细胞数量呈现降低的趋势。在试验过程中发现，K2HPO4为磷源的培养液中有颗粒状物质(磷酸铁沉淀)出现，铁含量越高产生的沉淀就越多，藻细胞可利用的磷源就越少，藻细胞的生长受到限制;低铁条件下，藻细胞可利用的磷源相对较多，铁含量相对较少，有利于藻细胞的生长。在试验中还发现，随着试验的进行磷酸铁沉淀在逐渐减少，其原因可能是随着试验的进行，培养液中藻细胞可直接利用的磷酸盐含量逐渐减少，当磷酸盐含量降低到一定量之后，磷酸铁沉淀作为磷源逐渐被藻细胞吸收利用。当有机磷作为磷源时未观察到沉淀产生，由于藻细胞会将有机磷吸附到细胞表面，水解产生的磷酸盐含量较少，可以被藻细胞直接吸收利用。在以NaGly为磷源时，低浓度的铁显著促进了藻细胞的生长，高浓度的铁对藻细胞数量的影响差异性不大，即高铁浓度也会抑制藻细胞的生长但抑制效果较弱。

2．1．2 不同铁浓度对藻细胞生长的影响

图4为不同磷源下藻细胞比增长速率与铁浓度关系。由图4可以看出，藻细胞在K2HPO4与NaGly为磷源的条件下细胞比增长速率较大，且二者的比增长速率并无显著性差异，在LEC为磷源的条件下比增长速率较小。在同一磷源条件下，微量元素铁对藻细胞比增长速率的影响并无显著性差异，都是随着铁浓度的减少，藻细胞的比增长速率逐渐增加，即在高氮低磷的条件下较低浓度的铁即可满足藻细胞生长的需求，而过高的铁浓度则会对藻细胞的生长产生抑制作用。其抑制作用的原因可能是因为藻细胞壁带有负电荷和一些含硫、氮和氧的官能团，它们较易与阳离子发生电荷吸引和进行螯合反应，使重金属沉积在藻细胞表面并通过细胞的生理过程转移到细胞内部，从而抑制藻类的光合作用、呼吸作用、酶的活性和生长[18-19]。另外，Fe3+与磷酸盐易产生沉淀也是限制藻细胞生长的原因之一。

图4 不同磷源下藻细胞比增长速率与铁浓度关系

2.2 藻细胞胞内总磷及APA的变化

图5 不同磷源下胞内总磷质量浓度及APA变化

图5 为不同磷源下胞内总磷浓度及APA变化。由图5可见，以K2HPO4为磷源时，藻液中总的APA在不断增加，不同的铁质量浓度对总的APA影响较大，铁质量浓度越低藻液中总的APA越多，不同铁质量浓度下藻细胞中的胞内总磷逐渐增加趋于稳定，铁质量浓度越低越有利于胞内总磷的累积。以NaGly为磷源时，藻液中总的APA也在不断增加，其中ρ(Fe)为50μg/L时总APA最高，ρ(Fe)为 1000μg/L产生的APA高于ρ(Fe)为500 μg/L条件下产生的APA，藻细胞中胞内总磷呈现出先增大后减少的趋势，不同铁浓度下藻细胞胞内总磷的变化也有所差异，ρ(Fe)为50 μg/L时藻细胞胞内总磷的变化趋势最为显著，其次是ρ(Fe)为1000 μg/L时。以LEC为磷源时藻液中总的APA波动性较大，不同的铁浓度未对APA产生显著性差异，藻细胞中的总磷呈现逐渐增加的趋势但增幅较小，不同的铁浓度对藻细胞中胞内总磷的影响较小。碱性磷酸酶属于胞外酶，其主要功能是从外界向细胞提供磷源，在细胞内磷源相对充足时酶的活性比较低。研究[20]显示，蓝藻在大分子有机磷作为磷源的情况下，培养基中的APA会迅速提高，而本研究中发现在LEC的培养条件下藻液中的APA较低，而在K2HPO4与NaGly培养条件下的APA在逐渐增多且增幅较大，但两者的APA并未出现显著性差异。APA与磷营养水平之间呈明显的负相关关系，这种关系常被称作“抑制-诱导机制”[21-22]，而本研究未发现胞内总磷与APA的相关性，其主要原因可能与铁和磷的共同作用有关。

2.3 藻细胞产毒状况

2．3．1 培养过程中藻毒素产量

本研究所用的铜绿微囊藻在生长过程中主要产生3种藻毒素异构体：MC-RR、MC-YR和MC-LR。在试验过程中发现MC-RR和MC-YR浓度非常低，几乎检测不到，我国GB 3838—2002《地表水环境质量标准》中规定MC-LR浓度限定值为0．001 mg/L，因此主要研究MC-LR在藻细胞生长过程中的变化。

图6为不同磷源下铜绿微囊藻毒素浓度。由图6可见，藻毒素浓度在3种不同磷源条件下培养过程中呈现出先增加后减少的趋势。以K2HPO4为磷源时，微量元素铁对藻毒素产生了显著性差异，其中 ρ(Fe)为500 μg/L 与 ρ(Fe)为50 μg/L 时藻毒素浓度相接近，ρ(Fe)为1000μg/L时藻毒素浓度显著偏低。 以 NaGly为磷源时，ρ(Fe)为1 000 μg/L与ρ(Fe)为500 μg/L时产生的藻毒素浓度相接近，而ρ(Fe)为50 μg/L时的藻毒素浓度显著高于其他浓度。以LEC为磷源时，不同铁浓度条件下藻毒素浓度的变化差异性较大，ρ(Fe)为50 μg/L时藻毒素浓度最高但波动性较大，ρ(Fe)为500 μg/L时藻毒素浓度较低但在持续增加，ρ(Fe)为1000μg/L时藻毒素浓度较低呈现出先增长后降低的趋势。以往研究发现一定的铁浓度有利于藻毒素的产生，而过高或过低的铁浓度都会对藻毒素产生抑制作用[23]，而本研究与此有所差异，其原因可能与磷源类型以及磷的质量浓度有关。

2．3．2 不同磷源条件下叶绿素a与胞内藻毒素的相关性

表1为藻细胞叶绿素a与胞内藻毒素(MCLR)相关性分析结果。由表1可见，不同磷源与不同铁浓度条件下，藻细胞在对数增长期(藻细胞比增长率大于5%的阶段)时叶绿素a质量浓度与胞内藻毒素(MC-LR)呈现正相关关系且相关性较高，这与以往的研究结果相一致[24]。但当藻细胞比增长率小于5%时，叶绿素a的浓度虽还有少量增加但藻毒素浓度却已经减少，即藻细胞产生藻毒素的衰减过程要早于藻细胞中叶绿素a的衰减过程。

图6 不同磷源下铜绿微囊藻毒素质量浓度

表1 藻细胞叶绿素a与胞内藻毒素(MC-LR)相关性分析

2．3．3 不同磷源条件下的特定产毒量

藻细胞的特定产毒量是评价藻细胞在生长过程中生成藻毒素的一个重要指标，它能更直观地反映出环境因素对于藻细胞产毒的影响。图7为不同磷源下藻细胞特定产毒量，可以看出，K2HPO4与NaGly更有利于藻毒素的生成。以K2HPO4为磷源时，微量元素铁对藻毒素的生成产生了显著影响，ρ(Fe)为500 μg/L时最有利于藻毒素的产生，此时藻细胞的数量也较高，因此总的藻毒素浓度较高。ρ(Fe)为1000μg/L时，藻细胞产生的藻毒素浓度最少，与LEC中藻细胞产毒量相接近，此时藻细胞数量最低，因此总的藻毒素含量也最低。ρ(Fe)为50 μg/L时，藻细胞产毒量较高与NaGly中藻细胞产毒量相接近，但由于藻细胞数量较高，因此总的产毒量较高。以NaGly为磷源时，不同铁浓度下的藻细胞产毒量相接近，其中ρ(Fe)为500 μg/L时藻细胞产毒量最低，ρ(Fe)为50 μg/L时藻细胞产毒量最高，此时藻细胞数量也最高，因此总的藻毒素含量最高，甚至超过了K2HPO4为磷源条件下的藻毒素含量。以LEC为磷源时，随着铁浓度的降低藻细胞中藻毒素浓度却在增加，即低铁浓度条件下更有利于藻毒素的产生。总的来说，以K2HPO4为磷源时，不同浓度的铁对藻细胞产毒量影响的差异性较大，即铁元素在其中发挥着重要作用;以NaGly为磷源时，藻细胞产毒量较高，不同浓度的铁对其影响较弱;以LEC为磷源时，藻细胞产毒量最低，不同的铁浓度对其产毒量影响较大，低铁浓度条件下更有利于藻毒素的产生。

图7 不同磷源下藻细胞特定产毒量

3 结 论

a.K2HPO4与NaGly对藻细胞生长的促进作用显著，K2HPO4条件下高浓度的铁会显著限制藻细胞的生长。

b. 以 K2HPO4为磷源时，ρ(Fe)为 500 μg/L 时最有利于单细胞的产毒;以NaGly为磷源时，单细胞的产毒量较大，不同铁浓度间的产毒量差异性不大;以LEC为磷源时，单细胞的产毒量最少，但低浓度铁有利于单细胞的产毒。

c.在对数增长期的培养阶段，藻细胞中的叶绿素a与胞内藻毒素呈现较强的线性相关性。

d.在不同磷源与微量元素铁的条件下，藻细胞胞内总磷与APA并未出现相关性。

e.NaGly与铁的共同作用对藻细胞生长与产毒的影响，在一定条件下比K2HPO4与铁对藻细胞生长与产毒的影响更为显著。因此，对以小分子有机磷为主要磷源水体的富营养化应更多关注微量元素铁对其的影响。