基于主成分分析和模糊评价法的豇豆成株期耐冷性综合评价和鉴定

黄海涛，胡 江，徐冬梅，林仁亨，谭华强，李焕秀*

(1.四川农业大学 园艺学院，四川 成都 611130；2.绵阳市农业科学研究院，四川 绵阳 621000)

【研究意义】豇豆原产于热带和亚热带区域，耐高温，不耐低温霜冻。秋延后栽培后期低温，抑制了豇豆的植株生长发育，开花结荚受到了严重的影响，虽然售价提高了，但产量大大降低了，不能产生较好的经济效益。我国在豇豆种质资源的收集和保存方面开展了大量的工作，已收集到豇豆资源3000多份，其中长豇豆1700多份[1]。近年来，育种工作者陆续开展了豇豆种质资源形态学鉴定、品质及抗性研究，在抗性研究方面，重点进行豇豆种质资源抗病性、抗虫性、抗旱性、耐冷性等方面的研究[2-6]。在豇豆耐冷性研究方面，为降低低温对豇豆生产的影响，豇豆科研和生产单位有意识的筛选晚熟、后期耐低温弱光、适宜秋延后栽培和早熟、适宜春提早栽培的豇豆品种和育种材料。众多学者在豇豆的生理、生化、形态、产量方面开展了耐冷性的评价，但主要停留在单一指标的评价，缺乏统一的标准[7-11]，单一指标的鉴定具有局限性，不同指标反映的耐冷性情况不尽相同，不能从客观上反映豇豆资源的耐冷性真实情况。【前人研究进展】主成分分析、隶属函数分析、聚类分析、回归分析法等综合评价的方法被广泛用于作物的抗逆性鉴定和品种评价。陈小凤开展了苦瓜、周亚峰开展了甜瓜、苗永美开展了黄瓜、徐新诚、刘微开展了番茄、陆新华开展了菠萝、徐小万、龙杰开展辣椒抗冷性综合评价和鉴定[12-18]。而基于主成分分析和模糊评价法的豇豆耐冷性综合鉴定与评价研究未见报道。田间自然低温鉴定法作为最有效的鉴定方法，最早用于耐冷性研究，在自然低温条件下，植物的耐冷性得以充分表现，也直接得到体现抗冷性的产量构成因素，因此，结果准确可靠。【本研究切入点】本研究采取田间自然低温处理，选取了与豇豆成株期低温逆境相关的18个形态学、生理学指标相对值进行豇豆耐冷性研究，采用主成分分析、隶属函数分析、聚类分析、回归分析法对豇豆成株期的耐冷性进行综合性评价，筛选豇豆成株期耐冷性最佳评价体系，探索直观、快速、有效的豇豆品种耐低温鉴定技术，【拟解决的关键问题】以期为豇豆成株期耐冷性鉴定、筛选和耐冷豇豆新品种的选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 参试材料

试验品种50个，由绵阳市农业科学研究院近年来从国内外育种科研单位收集而来并经单株留种提纯的种质资源。

1.2 田间处理及调查指标

1.2.1 田间低温处理 试验在绵阳市农业科学研究院蔬菜所游仙街子科研基地进行，对照组于2014年秋季正常播种期(8月5日)播种，处理组于15 d后(8月20)日播种。

表1 参试品种

1.2.2 田间调查方法 每次采收调查平均嫩荚粗、平均嫩荚重、平均单株产量、单株结荚数、平均荚长等形态学性状。最后一次采收期(对照组10月25日，平均气温18.6℃、处理组11月20日，平均气温10.8℃)调查电导率(EC)、叶绿素a含量(Ca)、叶绿素b含量(Cb)、叶绿素总量(CT)、可溶性蛋白含量(SP)、可溶性糖含量(SS)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)活性、抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性、超氧阴离子(SA)含量、丙二醛(MDA)含量、游离脯氨酸(Pro)含量。冷害指数于11月24日(最低气温8.9 ℃)调查处理组植株。冷害指数参考于超[19]标准对幼苗冷害症状进行分级；叶片叶绿素含量用分光光度计测定；可溶性蛋白含量用考马斯亮蓝G-520染色法测定；可溶性糖含量的测定采用蒽酮比色法；过氧化氢酶(CAT)活性的测定采用紫外吸收法；过氧化物酶(POD)活性用愈创木酚法测定；超氧化物歧化酶(SOD)活性用氮蓝四唑法测定；抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性采用紫外比色法； 超氧阴离子测定用羟胺氧化法；丙二醛含量用硫代巴比妥酸比色法测定；游离氨基酸含量用茚三酮显色法测定，以上生理生化指标均按李合生的方法测定[20]。

1.2.3 数据分析 相关指标计算及数据分析方法参照苗永美[14](2013)方法，采用 IBMSPSS 20.0软件对数据进行相关性分析、主成分分析、聚类分析和回归分析，获得各指标的贡献率，逐步回归法建立D值与指标之间的回归方程。

2 结果与分析

2.1 豇豆成株期耐冷性形态学鉴定指标的筛选及相关性分析

根据8月20日播种，后期低温处理和8月5日播种正常条件(CK)下嫩荚粗、嫩荚重、单株产量、单株结荚数、荚长形态学性状测定值, 计算各形态学性状指标的相对值，并各相对值的变异系数(表2)。

表2 不同豇豆品种成株期耐冷性相关形态学性状指标

续表2 Continued table 2

编号CIIRPT(%)RPW(%)RYP(%)RPP(%)RPL(%)252.4881.5380.2511.9726.3772.41262.7887.9869.53912.774.13272.5180.3650.6131.0626.1272.33282.8778.8982.5438.1620.8279.46292.4482.5574.4620.2229.1284.66302.4280.7759.8129.6110.9481.18312.3285.7455.0616.9912.6972.05324.1273.6856.1310.119.0474.39334.4867.6752.061.058.0373.14344.3065.4350.543.976.9380.43354.5177.6577.962.19.5984.22361.0091.5590.0773.7271.5288.42374.3455.3382.617.9715.9776.14384.4069.1770.093.617.9977.04392.3480.9860.9921.1222.0483.16402.6282.5881.8930.8118.2272.81412.7789.2349.2318.4910.975.97424.6378.2279.314.490.5979.66434.5975.164.8216.525.4487442.789150.1721.5124.7477.96454.1885.255.4229.522.9583.15464.1273.9574.981.083.8274.9474.1389.6372.921418.5662.83484.5384.469.9911.4319.2261.56492.5079.0377.4336.7628.286.28502.5572.4671.7934.6220.1781.03CV0.280.12 0.17 0.82 0.73 0.08

注：CII：冷害指数；RPT：相对嫩荚粗；RPW：相对嫩荚重；RYP：相对单株产量；RPP:相对单株结荚数；RPL:相对荚长；CV：变异系数，下同。

Notes: CII: Chilling injury index; RPT: Relative pod thickness; RPW: Relatively tender pod weight; RYP: Relative yield per plant; RPP: Relative pods per plant; RPL: Relative pod length；CV: Coefficient of variance, the same as below.

从形态学观察，冷害指数越大，植物耐冷性越差，8月20日播种的豇豆的平均嫩荚粗、平均嫩荚重、平均单株产量、平均单株结荚数、平均荚长都受到了影响，明显低于8月5日播种的豇豆。根据品种的耐冷性不同，不同品种的耐冷性形态学指标变化幅度表现为有一定差异，其中相对嫩荚粗(RPT)的变化幅度55.33 %～91.55 %、相对嫩荚重(RPW)的变化幅度49.23 %～90.07 %、相对单株产量(RYP)的变化幅度1.05 %～73.72 %、相对单株结荚数0.59 %～71.52 %、相对荚长(RPLL)的变化幅度为59.20 %～88.42 %。其中相对平均单株产量(RYP)和平均单株结荚数(RPP)受的影响最大(变异系数最大，分别为0.82、0.73)，说明晚播种后期低温对产量形态学指标产生明显的影响。

以冷害指数的倒数进行耐冷性评价，将50份豇豆材料的耐冷性、相对嫩荚粗、相对嫩荚重、相对单株重、相对单株结荚数、相对荚长进行相关性分析(表3)。

由表3可以看出，豇豆成株期的耐冷性与相对嫩荚粗、相对单株产量、相对单株结荚数、相对豆荚长成显著性的正相关。说明耐冷性越强，嫩荚粗度、豆荚长度、结荚数减小幅度越小，相对单株产量越大，说明冷害指数及上述4 个性状在晚播种后期冷胁迫与正常播种(CK)之比值可作为豇豆成株期耐冷性的鉴定适宜指标。

2.2 豇豆成株期耐冷性生理学鉴定指标的筛选

在2次不同播种期(8月5号、8月20日)的豇豆采收末期(播种后3个月)测定不同品种的电导率(EC)、叶绿素a含量(Ca)、叶绿素b含量(Cb)、叶绿素总量 (CT)、可溶性蛋白含量(SP)、可溶性糖含量(SS)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性、超氧阴离子(SA)含量、丙二醛含量(MDA)、游离脯氨酸含量(Pro)，结果见表4。

表3 豇豆成株期耐冷性状形态学指标相关性分析

注：CRI: 耐冷指数。

Notes: CRI: Chilling-resistance index.

表4 不同豇豆品种成株期耐冷性相关生理指标

续表4 Continued table 4

序号ECCaCbCTSPSSCATPODSODAPXSAMDAPro31 114.2371.2572.3779.82126.28128.8141.8116.3114.12100.51185.34174.36128.832 201.3355.4350.4374.89110.14108.69172.94126.9295.24112.82179.28171.68108.6932 211.5776.1156.6275.12104.56143.62191.3899.57122.5106.9143.58215.18143.6234 193.9754.8678.5160.38124.37135.18169.94104.15110.22129.43137.59184.97135.1835 175.3852.5240.7841.79106.19118.25167.71124.0392.97101.66110.26228.7118.2536 108.165.0166.5792.52141.63104.79126.9176.9128.78130.15110.71120.7190.7637 158.558.245.7478.28105.07118.24169.15126.55103.4100.92117.23177.02118.2438 197.7650.7953.2468.25133.4110.52219.2120.66120.96127.88119.55212.16110.5239 121.5159.0168.9778.63108.03125.01163.6106.46101.01116.34151.24169.06125.0140 150.2372.191.0992.391.68132.92182.83135.03134.8399.65105.24138.54132.9241 101.8469.2590.8778.95117.488.13217.86120.74124.46106.94166.65167.8888.1342 241.6744.0649.5870.32101.42125.91161.88130.27123.21119.76126.75232.01125.9143 168.2559.0740.4653.83115.74114.95180.7110.58121.59123.8178.45225.76114.9544 127.8161.5489.8957.0798.95122.66206.65135.1100.43104.96126.14191.29122.6645 201.2362.2862.2872.0498.12104.33140.26110.2108.72116.79193.85193.77104.3346 208.7242.7376.3163.3897.14143.59145.7896.1794.24129.51122.63163.31143.5947 197.1450.1469.7473.88105.88125.67207.03128.21112.47109.55163.65182.34125.6748 151.7141.8159.9455.31118.29143.84194.51122.1298.33117.64144.67237.75143.8449 137.5262.5373.5285.68108.4115.28165.09106.8114.1392.27133.53183.13115.2850 114.0391.7587.3987.64119.4593.3225.13119.43120.6393.73185.74139.2893.3CV0.23 0.22 0.24 0.20 0.11 0.14 0.17 0.12 0.10 0.10 0.20 0.18 0.14

注：EC：电导率；Ca：叶绿素a；Cb：叶绿素b；CT：叶绿素总量；SP：可溶性蛋白含量；SS：可溶性糖含量；CAT：过氧化氢酶；POD：过氧化物酶；SOD：超氧化物歧化酶；APX：抗坏血酸过氧化物酶；SA：超氧阴离子；MDA：丙二醛；Pro：游离脯氨酸。

Notes: EC: Conductivity; Ca: Chlorophyll a; Cb: Chlorophyll b; CT: Total chlorophyll ; SP: Soluble protein content; SS: Soluble sugar content; CAT: Catalase; POD: Peroxidase oxide dismutase; APX: Ascorbate peroxidase; SA: Superoxide anion; MDA: Malondialdehyde;Pro: Free proline.

由表4可以看出，50个豇豆品种在后期低温处理后生理指标表现有差异，8月20日播种的豇豆的叶绿素a含量(Ca)、叶绿素b含量(Cb)、叶绿素总量(CT)明显减小；电导率(EC)、丙二醛含量(MDA)、超氧阴离子含量(SA)明显增加了；可溶性蛋白含量(SP)在多数种质中呈增加的趋势，仅在9个品种中表现为下降；可溶性糖含量(SS)和游离脯氨酸含量(Pro)在多数品种表现为增加的趋势，在11个品种表现为下降；酶活性方面变化较为复杂，过氧化氢酶(CAT)酶活性增加、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)多数品种活性增加，少数品种活性降低。从变异系数来看，各生理指标的变异系数为0.10～0.24，明显低于形态学指标的变异系数0.08～0.73。说明形态学指标间的差异比生理指标表现为更大，生理学指标细小的差异都会影响到形态学综合表现为较大的差异。进一步对生理学指标的相对值进行相关性分析(表5)。

由表5可以看出，豇豆成株期的耐冷性与叶绿素总量、可溶性蛋白含量、POD活性、SOD酶活性呈显著性正相关，而与相对电导率、可溶性糖含量、丙二醛含量、游离脯氨酸酸含量呈显著负相关。与叶绿素a含量、叶绿素b含量、CAT酶活性、APX酶活性、超氧阴离子含量无显著性的相关关系。说明植株越耐冷、叶绿素总量越高，表现为叶色越深，叶片中的可溶性蛋白保持越高水平，抗氧化酶活性表现为较强的水平。越不耐冷，冷害指数越大，电解质外渗透越严重，相对电导率越高，细胞质膜透性越大，细胞质膜受到的损伤就越大，丙二醛含量也越高，大量的脯氨酸积累，脯氨酸含量大大升高。

2.3 豇豆成株期耐冷性主成分分析和耐冷性评价

考虑到形态学指标相对嫩荚粗(RPT)、相对单株产量(RYP)、相对结荚数(RPP)、相对豆荚长(RPL)以及生理学指标相对电导率(EC)、叶绿素总量(CT)、可溶性蛋白含量(SP)、可溶性糖含量(SS)、过氧化物酶(POD)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛含量(MDA)、游离脯氨酸含量(Pro)的相对值与豇豆成株期耐冷性相关性显著。它们表征耐冷性的信息有所重叠, 因此选择单项指标难以准确客观地反映不同豇豆品种的成株期耐低温的能力。将与豇豆成株期耐冷性相关性显著的形态学指标相对嫩荚粗(RPT)、相对单株产量(RYP)、相对结荚数(RPP)、相对豆荚长(RPL)以及生理学指标电导率(EC)、叶绿素总量(CT)、可溶性蛋白含量(SP)、可溶性糖含量(SS)、过氧化物酶(POD)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛含量(MDA)、游离脯氨酸含量(Pro)的13个指标相对值标准化后进行主成分分析(表6)。

表5 豇豆成株期耐冷性生理指标相关性分析

表6 各主成分的特征向量及贡献率

由表6可以看出，前7个主成分的累计贡献率达到86.812 %，分别为40.280 %、11.798 %、8.207 %、7.569 %、7.126 %、6.699 %和5.133 %, 累计贡献率大于85 %，即这7个综合指标的贡献率即可解释86.812 %的总变异，因此, 这7个独立的综合指标(CI1～CI7)可代表13个单项指标的绝大部分信息。第1主成分(PC1)中耐冷指数(CRI)、相对单株产量(RYP)特征向量最大，为0.170、0.158；第2主成分(PC2)中可溶性糖含量(SS)、游离脯氨酸(Pro)含量特征向量最大，为0.506、0.478；第3主成分(PC3)中相对豆荚长(RPL)、可溶性蛋白(SP)特征向量最大，为0.653、0.414；第4主成分(PC4)中超氧化物歧化酶活性(SOD)、相对单株结荚数(RPP)、叶绿素总量(CT)特征向量最大，为0.652、-0.434、0.398；第5主成分(PC5)中超氧化物歧化酶活性(SOD)、丙二醛含量(MDA)、过氧化物酶(POD)、相对嫩荚粗(RPT)得特征向量最大，为0.520、0.437、0.386、-0.438；第6主成分(PC6)中相对豆荚长(RPL)、可溶性蛋白(SP)特征向量最大，分别为0.485、-0.792；第7主成分(PC7)中相对电导率(EC)、相对过氧化物酶(POD)活性特征向量最大，分别为0.656、0.693。

2.4 豇豆成株期耐冷性综合评价

由表7显示，根据7个主成分的特征向量及各指标的相对值求出50份材料的7个综合指标，隶属函数值， 根据权重和隶属函数值，进一步计算出综合评价值D，以D值大小对50份豇豆品种的耐冷性进行排序。

表7成株期各品种的综合指标(CI)、隶属函数值(μ)、综合评价值(D)和预测值(VP)

Table 7 Comprehensive index (CI), membership function value (μ), comprehensive evaluation value (D) and prediction value (VP) of the adult plant stage

CI1CI2CI3CI4CI5CI6CI7μ(1)μ(2)μ(3)μ(4)μ(5)μ(6)μ(7)DVP排名10.0331.3020.8820.550-1.483-0.5000.9920.2900.7130.8100.7090.2110.4050.7380.4010.3931220.275-0.003-1.521-0.542-0.7510.3750.1630.3300.4230.1670.4550.3840.5650.5490.3250.3283530.3210.667-0.9291.1011.063-0.132-0.8670.3390.5720.3250.8370.8120.4720.3150.4000.3961340.1550.8430.7280.6100.8291.140-2.2550.3100.6110.7690.7230.7570.706-0.0010.4160.423951.0530.2070.766-1.102-0.4900.1500.7730.4660.4700.7790.3250.4460.5240.6880.4340.42056-0.7141.6460.5730.900-1.0330.2241.4920.1580.7890.7270.7900.3170.5380.8510.3790.3561771.007-0.005-0.685-0.1780.770-2.0401.2250.4580.4230.3910.5390.7430.1210.7900.4090.392118-0.383-1.9111.066-1.001-0.8240.122-1.1580.2160.0000.8590.3480.3670.5190.2490.2570.276479-1.207-0.2750.224-0.9490.9060.7442.0140.0740.3630.6340.3600.7750.6340.9700.2990.2893910-0.821-0.1290.6271.3181.557-0.4600.8940.1390.3950.7420.8870.9290.4120.7150.3610.3412111-0.061-0.8110.1660.280-0.1391.1330.1510.2720.2440.6180.6460.5290.7050.5460.3510.3572612-0.474-0.784-1.440-0.8781.366-0.104-0.6640.2000.2500.1890.3770.8840.4770.3610.2680.2724613-1.059-0.3751.283-0.205-0.6920.772-0.9080.0980.3410.9170.5330.3980.6390.3060.2820.2974314-1.6040.9231.593-0.4510.3850.538-0.0300.0030.6291.0000.4760.6520.5960.5050.3060.2953815-1.6330.117-0.467-2.0401.860-0.496-1.035-0.0020.4500.4490.1061.0000.4050.2770.2100.2045016-0.042-1.1450.9050.3120.458-1.077-0.1160.2750.1700.8160.6530.6700.2980.4860.3400.3443017-1.2640.622-1.4970.1551.426-0.1450.1900.0620.5620.1730.6170.8980.4700.5550.2760.2754418-0.721-1.0360.0690.5631.0151.485-0.3430.1570.1940.5920.7120.8010.7700.4340.3200.33936190.2411.002-0.7050.2250.5352.735-1.0900.3250.6470.3850.6330.6881.0000.2640.4160.4398200.413-1.473-0.2490.977-0.121-0.5460.2690.3550.0970.5070.8080.5330.3960.5730.3510.35825210.575-1.305-0.871-0.432-1.177-0.0671.3440.3830.1340.3410.4800.2830.4840.8170.3290.34131220.2220.251-1.7301.8010.0790.8030.2730.3210.4800.1111.0000.5800.6440.5740.3850.40815230.798-1.4270.612-1.3351.154-0.0810.4400.4220.1070.7380.2700.8340.4820.6120.3870.40914240.2100.7071.4460.443-1.099-2.7010.3020.3190.5810.9610.6840.3020.0000.5810.3790.35216250.487-1.182-0.832-0.206-0.4820.171-0.1860.3680.1620.3510.5330.4480.5280.4700.3280.32833260.331-1.706-1.319-0.186-1.9110.8790.7760.3400.0450.2210.5380.1100.6580.6880.2880.31741271.234-1.277-0.3200.478-0.225-1.091-1.7880.4980.1410.4880.6920.5080.2960.1060.3710.36218281.090-1.0440.6140.5991.097-0.050-1.8730.4730.1920.7380.7200.8200.4870.0860.4240.4327290.975-0.0280.5200.6630.0120.3620.5730.4530.4180.7130.7350.5640.5630.6420.4570.4383300.7950.157-0.2281.2350.4040.3811.5580.4210.4590.5130.8680.6570.5670.8660.4610.4612310.3400.937-0.6350.047-0.403-2.091-0.8490.3420.6320.4040.5920.4660.1120.3190.3470.3442832-0.276-0.3590.008-1.070-0.745-0.2941.3470.2350.3440.5760.3320.3860.4420.8180.3070.2853732-1.3811.161-0.3761.3430.007-0.434-0.6380.0420.6820.4730.8930.5630.4170.3670.2910.2744034-1.0390.6751.4310.6200.067-1.104-0.3630.1010.5740.9570.7250.5770.2940.4290.3250.3013435-0.958-0.4681.010-1.555-0.2941.0750.6440.1160.3200.8440.2190.4920.6940.6580.2860.30942364.1142.5931.222-1.9781.6130.7100.8431.0001.0000.9010.1210.9420.6270.7030.7490.737137-0.4280.2880.1550.0230.2760.170-0.0830.2080.4880.6150.5860.6270.5280.4930.3420.3182938-0.487-0.4520.7660.6021.607-1.3211.2000.1980.3240.7790.7210.9410.2540.7850.3610.32322

续表7 Continued table 7

CI1CI2CI3CI4CI5CI6CI7μ(1)μ(2)μ(3)μ(4)μ(5)μ(6)μ(7)DVP排名390.2940.7980.617-0.208-1.836-0.114-1.1850.3340.6010.7390.5330.1280.4760.2430.3600.36923400.5801.685-2.1461.442-0.5260.694-0.5690.3840.798-0.0010.9160.4370.6240.3830.4110.42010411.014-1.555-0.8000.686-0.052-0.753-0.1450.4590.0790.3600.7400.5490.3580.4790.3680.3752042-0.9940.389-0.4230.9400.5260.9212.1470.1090.5100.4610.7990.6850.6661.0000.3470.3512743-0.510-0.4911.4620.7870.7950.556-0.2510.1940.3150.9650.7640.7490.5990.4550.3690.37819440.2220.547-0.645-1.940-0.9281.105-0.4400.3210.5450.4010.1300.3420.7000.4120.3290.36532450.078-0.6350.702-0.314-1.1991.2640.2370.2960.2830.7620.5080.2780.7290.5660.3510.3612446-1.4330.7950.086-0.038-2.378-0.452-0.6690.0330.6010.5970.5720.0000.4130.3600.2230.2334847-0.3020.485-2.052-1.008-0.456-0.8270.3810.2300.5320.0250.3460.4540.3450.5990.2700.2664548-0.9701.166-1.306-2.4970.356-1.644-1.0820.1130.6830.2240.0000.6450.1940.2660.2170.21949490.6880.5951.0790.431-0.9470.524-1.0870.4030.5560.8630.6810.3380.5930.2650.4280.4276501.219-0.6810.5640.9810.029-0.505-0.5550.4950.2730.7250.8090.5680.4040.3860.4400.4244

D值大小反映了豇豆成株期耐冷性的强弱， 15号豇豆(宁豇3号)D值为0.210，在所有参试品种中耐冷性最弱。

为更精确地分析豇豆耐冷性与形态学和生理指标之间的关系，建立可靠的豇豆耐冷性评价数学模型，以D值为因变量，以各单项指标的不同播种期的相对值为自变量进行逐步回归分析，建立了最优的回归方程：D=-0.481+0.210*X1+0.157X3+0.494X5+0.128X10+0.178X11，方程决定系数R2= 0.972，P=0.013845，达显著水平。其中X1、X3、X5、X10、X11分别代表耐冷指数(CRI)、相对单株产量(RYP)、相对豆荚长(RPL)以及生理学指标超氧化物歧化酶(SOD)活性过氧化物酶、(POD)活性的相对值。将相关数据代入回归方程得到预测值，相关分析表明，50个豇豆品种的成株期耐冷预测值(VP)与综合评价值(D)之间的相关系数为0.981，呈极显著正相关，说明该回归方程可用于豇豆的萌芽期耐冷性综合评价，准确度高。豇豆植株在冷胁迫下受到伤害，变短，单株产量减，酶活性增强。

采用平均组间连接法中的 Euclidean 距离法对各品种D值聚类分析。由图1可以看出，在欧式距离25处，参试的50个豇豆品种被明显分为2种类型，即耐冷极强的从迪拜引进的豇豆(1个品种：36号)和从我国各省份引进的耐冷一般的豇豆类型(49个品种)；在欧式距离8～10之间，耐冷一般的豇豆类型被分为耐冷中等的豇豆类型(46个品种)和冷敏感的豇豆类型(3个品种：15、48、46)。在欧式距离5～8之间，耐冷中等的豇豆类型进一步被分为耐冷较好的(12个品种)和耐冷较差(34个品种)类型。即在欧式距离5～8之间，所有参试的50个品种被分为4种类型：I类极强耐冷型豇豆(1个品种)、II类耐冷较好型(12个品种)、III类耐冷较差豇豆(34个品种)、IV类冷敏感型(3个品种)。

3 小 结

本研究采取自然低温处理，选取了与豇豆成株期低温逆境相关的18个形态学、生理学指标相对值进行豇豆耐冷性研究，将其中18个指标与豇豆的冷害指数进行相关性分析，并进一步选取了与豇豆冷害指数相关性显著的13个指标进行主成分分析，将13个指标转换为7个独立的综合指标(CI1～CI7)，在计算豇豆材料的隶属值的基础上进一步利用各综合指标的贡献率计算豇豆的耐冷综合评价值，在将耐冷综合评价值进行排序，并采用平均组间连接法中的 Euclidean 距离法对各品种D值聚类分析，有效消除了各指标之间的相关性, 避免信息重叠,获得了耐冷性极强的豇豆种质1份(迪拜豇豆)，耐冷性较强的豇豆种质12份(29、30、28、49、5、50、1、3、4、19、7、40)和冷敏感豇豆种质3份(46、18、15)。

以D值为因变量，以各单项指标的不同播种期的相对值为自变量进行逐步回归分析，建立了最优的回归方程：D=-0.481+0.210*X1+0.157X3+0.494X5+0.128X10+0.178X11，通过回归方程分析，从13个指标中进一步筛选了耐冷指数(CRI)、相对单株产量(RYP)、相对豆荚长(RPL)以及生理学指标超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶、(POD)活性的相对值作为豇豆成株期耐冷性评价的指标，利用它们对不同耐冷性豇豆品种进行评价，预测值和耐冷性综合评价值相关性显著，说明这6个指标是豇豆成株期耐冷性评价的较好的筛选鉴定指标，该方程可评价不同豇豆类型的耐冷性，是一套可操作性强的豇豆耐冷性评价体系。

图1 豇豆成株期耐冷性综合评价指标D值聚类图Fig.1 Cowpea chilling resistance comprehensive evaluation index D value cluster diagram of the adult plant stage

4 讨 论

植物耐冷性是多基因控制的数量性状。植物应对低温胁迫的能力是一个多系统的综合生理反应，既受遗传基因的控制，也受环境的影响。采用单一的形态学或生理学指标来评价豇豆的耐冷性，结果差异较大。分析形态学和生理学各指标的相关性，发现多数指标与耐冷指数以及各指标间多数相关系数显著，说明信息重叠较多，用单一的指标来评价豇豆的耐冷性具有较大的局限性，需要利用综合评价的手段来对豇豆的耐冷性进行评价，提高评价的准确性。本研究采取不同播种时期的豇豆形态学指标和生理学指标的相对值来评价豇豆的耐冷性，消除了不同豇豆本身品种固有的特性，有效地反映了品种在低温和正常温度下各性状指标受低温影响变化的幅度，指标选择具有科学性。

研究发现8月20日播种的豇豆植株后期受冷胁迫，植株生长受到了明显的影响，豇豆都加相对正常播种时期(8月5日播种)的豇豆植株豆荚变细，有花而不实和落花落荚的现象，结荚数变少，最终导致相对产量减少；低温下，豇豆的生理生化指标也受到了很大的影响。低温胁迫下，细胞膜系统受到损伤，膜透性增加，膜脂过氧化程度明显加剧，丙二醛(MDA)含量明显增加，但耐冷性的品种植株中丙二醛(MDA)和电导率上升幅度小，说明低温胁迫下耐冷性强的豇豆膜脂质过氧化程度较弱，低温对耐冷品种细胞膜的损伤相对较小；可溶性糖、游离脯氨酸、可溶性蛋白是植物抗冷性相关的3种重要的渗透调节物质，本研究结果表明低温胁迫下多数品种的可溶性糖、可溶性蛋白、游离脯氨酸等指标呈增加的趋势，但不同耐冷性的品种变化幅度不尽相同，可溶性糖和游离脯氨酸的含量与品种的耐冷性呈显著性的负相关，可溶性蛋白与品种的耐冷性呈显著正相关；本试验豇豆品种在低温下植株黄化，叶色变淡，在生理指标上表现为叶绿素含量降低，不耐冷的品种降低更为明显；在低温胁迫下植物体内的活性氧增加了，为了减轻活性氧对植物细胞的损伤，抗氧化酶超氧化物酶(SOD)、过氧化物酶(POD)活性明显增强，特别是抗氧化酶(POD和SOD)与豇豆的耐冷性呈明显的正相关，说明低温诱导了抗氧化酶的活性，耐冷的品种抗氧化酶活性增加幅度更大，活性氧的清除能力强于耐冷性弱的品种，减轻了活性氧对豇豆细胞的伤害。本研究发现，生理指标的相对值的变异系数明显小于形态学指标的变异系数，说明植株生长过程中，低温胁迫处理下生理学指标的细小差异在形态学指标表现为差异较大。