联合检测Sp1、KLF8、Cyclin D1及P16在卵巢浆液性肿瘤中的表达及预后意义

顾静凤 陈芳 张菊平 高小姣 邓志勇(通讯作者)

215300昆山第一人民医院，江苏 昆山

卵巢恶性表面上皮-间质肿瘤占卵巢恶性肿瘤的90%以上[1]，其中浆液性肿瘤比例最高，但由于解剖部位隐蔽、内分泌功能复杂及临床症状不典型，导致不能早期及时准确诊断，5年存活率始终徘徊在30%上下[2]，且不同患者预后差异很大。因此，寻找特异的预后指标和靶向治疗分子显得尤为重要。免疫组化染色在鉴别卵巢浆液性肿瘤与分级等方面有一定的意义，目前应用于卵巢浆液性肿瘤诊断与预后的3 个指标是：转录因子特 化 蛋 白 -1(transcription specificity protein 1)Sp1、多肿瘤抑制基因(MTS1)P16、局部黏着斑激酶(FAK)KLF8。而细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)是近几年卵巢浆液性肿瘤在分子遗传学方面的研究热点，是KRAS/BRAF/MEK/MAPK 信号通路中的一个下调靶点，过度表达于卵巢交界性肿瘤或低级别浆液性癌中[3]。本文联合检测Sp1、KLF8、P16 及Cyclin D1在卵巢浆液性肿瘤中的表达及相关性的研究，并分析其临床病理特征及预后，旨在提高卵巢浆液性肿瘤的病理诊断的准确率。

资料与方法

2008年1月-2017年12月选取手术切除的卵巢浆液性囊腺癌石蜡标本50 例作为观察组，术前均未行化疗、放疗或激素治疗，有完整的临床病理；同时收集同期存档的卵巢浆液性囊腺瘤及卵巢交界性浆液性囊腺瘤各20 例作对照组。观察组患者年龄27～82 岁，平均52岁；＜50 岁19 例，≥50 岁31 例；临床分期采用国际妇产科联盟(FIG0)2000年标准，Ⅰ期19例，Ⅱ期11例，Ⅲ期、Ⅳ期20 例；术后证实有淋巴结转移者14例，无淋巴结转移者36 例。组织分级采用WHO 标准，高级别28 例，低级别22 例；主要试剂：Sp1 及KLF8 单抗隆抗体；Cyclin D1 兔抗人单克隆抗体及P16 鼠抗人单克隆抗体；DAB显色试剂盒。

方法：采用免疫组化SP 法染色，具体操作步骤按试剂盒说明书进行，阳性对照选择已知的阳性病理切片，阴性对照选择磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗。

结果判定：P16 的阳性表达定位于细胞核及部分细胞质，Sp1、KLF8 及Cyclin D1 的阳性表达定位于细胞核，阳性反应的判断标准为于蛋白表达定位区有棕褐色或棕黄色颗粒出现，随机选取10 个有代表性的高倍镜视野，每个视野计数100 个肿瘤细胞，评分依据着色度与着色细胞百分比计分的乘积进行，阳性表达率的计算方法为阳性细胞数/总细胞数×100%[4]。

统计学方法：采用SPSS 18.0 统计学软件分析数据。计数资料以[n(%)]表示，采用χ2检验，相关分析采用Spearman秩相关性；P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

Sp1、KLF8、Cyclin D1和P16在卵巢浆液性肿瘤中的表达情况：Sp1在卵巢浆液性囊腺癌、交界性浆液性囊腺瘤和浆液性囊腺瘤中的表达率依次降低，分别为68.0%、25.0%和15.0%，三者比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，但交界性浆液性囊腺瘤和浆液性囊腺瘤相比，其表达比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。在卵巢浆液性囊腺癌、交界性浆液性囊腺瘤和浆液性囊腺瘤中KLF8阳性表达率依次降低，分别为64.0% 、40.0% 和10.0%，三者比较，差异有统计学意义(P＜0.05)；Cyclin D1 在卵巢浆液性囊腺癌、交界性浆液性囊腺瘤和浆液性囊腺瘤中的阳性表达率分别为48.0%、80.0%和20.0%，每两组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)；P16 在卵巢浆液性囊腺癌、交界性浆液性囊腺瘤和浆液性囊腺瘤中的表达率依次升高，分别为18.0%、50.0%和70.0%，三者比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，但交界性浆液性囊腺瘤和浆液性囊腺瘤相比，其表达比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。

Sp1、KLF8及Cyclin D1、P16表达与卵巢浆液性囊腺癌临床病理特征的关系：Sp1的阳性表达率与患者临床分期及淋巴结转移呈正相关，FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期患者中Sp1 蛋白的阳性率显著高于Ⅰ～Ⅱ期，Sp1蛋白的阳性率淋巴结转移患者显著高于无淋巴结转移者，差异有统计学意义(P＜0.05)，与患者年龄及病理分级无相关性(P＞0.05)。P16的阳性表达率与病理分级、临床分期有关(P＜0.05)。P16 在Ⅲ～Ⅳ期卵巢浆液性癌中的表达低于Ⅰ～Ⅱ期；在高级别癌中的表达低于低级别癌，差异有统计学意义(P＜0.05)，与患者年龄、淋巴结是否转移无相关性(P＞0.05)。

KLF8、Cyclin D1 的阳性表达率与患者的临床病理特征包括患者年龄、病理分级、淋巴结转移及临床分期均无相关性(P＞0.05)。

讨 论

Sp1 和KLF8 同属于Sp1/KLFs 家族，均是具有锌指结构的转录因子，本研究发现，Sp1阳性率在卵巢浆液性囊腺癌中高于卵巢交界性囊腺瘤及浆液性囊腺瘤，差异有统计学意义(P＜0.05)，提示Sp1可能参与了卵巢浆液性囊腺癌的发生和发展，其也可以作为卵巢浆液性囊腺癌的诊断指标。临床分期及淋巴结转移与否和Sp1 关系密切，呈显著正相关，差异有统计学意义(P＜0.05)，提示在卵巢浆液性囊腺癌的侵袭与转移过程中，Sp1可能起到了一定的作用，其是卵巢浆液性囊腺癌预后不良的一个因素，在分析肿瘤浸润和临床分期的基础上，结合检测Sp1 的表达可提高对卵巢浆液性囊腺癌患者预后判断的准确性。

KLF8 位于人类X 染色体，包含359个氨基酸残基。主要通过激活或抑制富含GC盒的启动子调控基因的表达，广泛参与细胞增殖、分化及凋亡。本研究结果显示，在50 例卵巢癌浆液性囊腺癌标本中，KLF8 呈高表达(阳性率达64.0%)；KLF8在正常卵巢组织中不表达；在卵巢良性上皮性肿瘤的表达率很低。鉴于KLF8表达在卵巢良、恶性肿瘤之间的差异显著，提示KLF8可能参与了卵巢浆液性囊腺癌的发生发展过程。同时分析发现，KLF8的阳性表达率与患者的临床病理特征包括病理分级、年龄、淋巴结是否转移及临床分期等病理特征间无相关性(P＞0.05)。Cyclin D1 基因位于染色体11q13，在细胞周期G1至S期发挥调控作用，促进细胞增殖，致癌因素可导致Cyclin D1过表达，引起癌变[5]，本研究结果显示，浆液性交界性肿瘤组织中Cyclin D1 蛋白的阳性表达率明显高于卵巢浆液性癌，差异有统计学意义(P＜0.01)，低级别浆液性癌组织中Cyclin D1的阳性表达率虽高于高级别浆液性癌，但两者比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。虽然本组的病例数有限，但仍可以看出低级别浆液性癌和浆液性交界性肿瘤可能具有相同的致病途径。卵巢高级别浆液性癌与低级别浆液性癌的发病机制不同，而交界性浆液性肿瘤与低级别浆液性癌的关系可能更为密切，这也是有关卵巢癌发病机制中比较新的观点[6]。Cyclin D1 的阳性表达率与患者的临床病理特征包括患者的年龄、病理分级及临床分期等病理特征间无相关性(P＞0.05)。Cyclin D1 阳性表达率在无盆腔淋巴结转移的浆液性卵巢癌组织中明显高于有盆腔淋巴结转移者，但差异无统计学意义(P＞0.05)。多肿瘤抑制基因(MTS1)亦称P16 基因，P16 蛋白是细胞周期素依赖性激酶(CDK4)的抑制因子。本研究进一步证实，P16在卵巢交界性浆液性囊腺瘤及浆液性囊腺瘤中呈高表达，而在卵巢浆液性囊腺癌中呈低表达，仅为18.0%，差异有统计学意义(P＜0.05)，说明在卵巢癌发展过程中P16 活性下降，刺激细胞分裂，从而使细胞失去控制，趋于恶性化。P16 在Ⅲ～Ⅳ卵巢浆液性癌中的表达低于Ⅰ～Ⅱ；在有淋巴结转移的癌中低于无淋巴结转移的癌，统计结果显示，差异有统计学意义(P＜0.05)，提示P16 作为卵巢浆液性囊腺癌的诊断指标和预后具有一定价值。