NKp44+NK细胞在1型糖尿病患者外周血中的表达*

薛君力，李兰芳，李琳芸，曾姣娥，张娟

（湖北省荆州市中心医院 1.内分泌科，2.检验科，湖北 荆州 434020）

1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus, T1DM）是自身免疫性疾病[1]，其主要与T淋巴细胞、B淋巴细胞及NK细胞等作用相关[2-3]。表达自然杀伤组2D+（natural killer group 2D, NKG2D+）等受体的NK细胞与1型糖尿病发生相关[4-7]。表达NKp44+受体的自然杀伤（natural killer, NK）细胞最早发现于扁桃体腺，主要分泌白细胞介素22（Interleukin-22, IL-22）等炎症因子[8]。IL-22与1型糖尿病发生密切相关[9]。NKp44+NK细胞是IL-22的重要分泌细胞，其也可能与1型糖尿病发病密切相关，本研究拟通过检测1型糖尿病患者外周血中的NKp44+NK细胞及IL-22表达，探讨其与1型糖尿病发生的可能相关机制。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2014年6月—2015年12月湖北省荆州市中心医院就诊的1型糖尿病患者19例。其中，男性12例，女性7例；平均年龄（34±13）岁。募集年龄及性别相匹配的健康对照组20例。其中，男性13例，女性7例；平均年龄（32±13）岁。两组年龄、性别差异无统计学意义（P＞0.05）。1型糖尿病依据中华医学会糖尿病学分会2013年版《中国1型糖尿病诊治指南》诊断。排除标准：发生酮症酸中毒未行纠正者；急慢性感染；严重的器官损害：肝、肾、心血管及肺部；严重的精神病患者；妊娠者。本研究获该院医学伦理委员会审核通过，所有受试者均获得知情同意，并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 常规生化指标及糖尿病慢性并发症筛查 两组均在清晨空腹状态下抽血采血，全自动生化分析仪检测血胱抑素c、促甲状腺激素及血脂（三酰甘油、胆固醇、低密度脂蛋白及高密度脂蛋白）等指标。高压液相法检测糖化血红蛋白，酶联免疫吸附测定（ELISA）检测谷氨酸脱羧酶抗体及胰岛素相关抗体，放射免疫法检测空腹C肽。糖尿病肾脏病变、糖尿病周围神经病变、糖尿病视网膜病变及糖尿病下肢动脉病变诊断均参照2013年版中国2型糖尿病防治指南。

1.2.2 IL-22检测 采用ELISA检测试剂盒（BMS2047 eBioscience奥地利赛默飞公司）检测血清中IL-22水平。利用试剂盒提供的标准品梯度稀释后检测获得标准曲线。将获得的血清标本按ELISA试剂盒说明书操作进行检测，利用标准曲线计算血清中IL-22浓度。

1.2.3 流式细胞仪检测NKp44+NK细胞 取受试者血液100 μl，分别依次加入PE-CD336（NKp44+）10 μl（IM3710 clone Z231，法国贝克曼公司）、ECDCD3 5μl（IM2705U clone UCHT1，法国贝克曼公司）及PC5-CD56 5μl（A07789 clone N901，法国贝克曼公司），同时每管加好同型对照（法国贝克曼公司）减少由于抗体非特异性结合所致的背景染色。室温避光孵育30 min，加入红细胞溶解液0.5 ml，迅速混匀，室温避光孵育10 min，室温3 000 r/min，离心5 min，去除上清 ，加入1.5 ml磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline, PBS）重悬细胞，室温3 000 r/min，离心5 min，移去上清液，加入300μl PBS重悬细胞，流式细胞仪（法国贝克曼公司）检测NKp44+细胞比例。NKp44+NK细胞表面标记定义为CD3-CD56+NKp44+。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验。正态分布的两变量相关分析采用Pearson分析，偏态分布变量采用Spearman分析。非正态分布采用秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 1型糖尿病患者NKp44+NK细胞比例及IL-22表达

外周血中NKp44+NK细胞占外周血有核细胞比例，在1型糖尿病患者中为（0.030±0.018）%，而在对照组中的比例为（0.001±0.001）%，两者比较差异有统计学意义（t=7.285，P=0.000）（见图 1）。1型糖尿病患者外周血中IL-22浓度与对照组比较差异有统计学意义（t=4.097，P=0.000），1型糖尿病患者IL-22浓度（48.598±10.672）pg/ml较对照组IL-22浓度（35.847±7.923）pg/ml升高。

2.2 1型糖尿病患者中NKp44+NK细胞比例与IL-22相关性分析

1型糖尿病患者外周血中IL-22浓度与NKp44+NK细胞比例呈正相关（r=0.513，P=0.025）。见图2。

2.3 1型糖尿病患者NKp44+NK细胞比例及IL-22与患者实验室指标间的相关分析

利用相关性分析发现1型糖尿病患者外周血中IL-22、NKp44+NK细胞比例与年龄、病程、收缩压、舒张压、空腹血糖、谷氨酸脱羧酶抗体、胰岛素相关抗体、胰岛素生长样因子、胱抑素c、促甲状腺激素、三酰甘油、胆固醇、低密度脂蛋白及高密度脂蛋白等均无相关；NKp44+NK细胞比例与糖化血红蛋白相关（r=0.465，P=0.045）。见表 1。

图1 1型糖尿病患者及对照组外周血NKp44+NK流式细胞仪检测结果

图2 NKp44+NK细胞比例与IL-22相关性分析

2.4 1型糖尿病患者NKp44+NK细胞及IL-22与糖尿病慢性并发症的关系

表1 1型糖尿病患者资料及相关性分析

对于1型糖尿病以有无糖尿病下肢动脉病变、糖尿病肾脏病变、糖尿病视网膜病变及糖尿病周围神经病变等并发症进行分类，分析各患者间NKp44+NK细胞比例及IL-22表达差异。结果显示在无糖尿病周围神经病变患者NKp44+NK细胞比例较糖尿病周围神经病变患者升高（t=2.970，P=0.009），NKp44+NK细胞比例在有无糖尿病下肢动脉病变、糖尿病肾脏病变及糖尿病视网膜病变患者间差异无统计学意义（P＞0.05）（见表2）。IL-22表达在有无糖尿病下肢动脉病变、糖尿病肾脏病变、糖尿病视网膜病变及糖尿病周围神经病变患者间差异无统计学意义（P＞0.05）（见表3）。

表2 1型糖尿病患者NKp44+NK细胞比例与慢性并发症的关系 （%，±s）

表2 1型糖尿病患者NKp44+NK细胞比例与慢性并发症的关系 （%，±s）

并发症 糖尿病肾脏病变 糖尿病视网膜病变 糖尿病周围神经病变 糖尿病下肢动脉病变有0.029±0.018（n =6） 0.029±0.011（n =8） 0.018±0.005（n =5） 0.025±0.007（n =2）无0.033±0.019（n =13） 0.032±0.023（n =11） 0.034±0.019（n =14） 0.031±0.019（n =17）t值 0.539 0.365 2.970 0.407 P值 0.597 0.720 0.009 0.689

表3 1型糖尿病患者IL-22表达与慢性并发症的关系 （%，±s）

表3 1型糖尿病患者IL-22表达与慢性并发症的关系 （%，±s）

并发症 糖尿病肾脏病变 糖尿病视网膜病变 糖尿病周围神经病变 糖尿病下肢动脉病变有52.759±10.910（n =6） 50.041±11.692（n =8） 45.933±8.790（n =5） 45.884±19.167（n =2）无46.036±10.421（n =13） 47.581±10.875（n =11） 49.550±11.412（n =14） 48.923±10.214（n =17）t值 1.166 0.461 0.640 0.371 P值 0.260 0.651 0.531 0.715

3 讨论

NKp44+NK细胞以其表面表达的细胞毒性受体命名的一类NK细胞，属于CD56bright NK细胞亚类，表面表达趋化因子受体6（chemokine receptor 6, CCR6）、CD96和CD103等多种趋化因子受体，并分泌IL-22、IL-26及白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor,LIF）等黏膜免疫相关分子[8]。研究证实，NKp44+NK细胞在强直性脊柱炎[10]及原发性干燥综合征[11]等自身免疫性疾病表达升高。在类风湿性关节炎患者外周血中NKp44+NK细胞比例增加，并通过IL-22调控滑膜细胞增殖来参与类风湿性关节炎发生[12]，本研究也证实另一类自身免疫性疾病1型糖尿病患者中NKp44+NK细胞及IL-22表达升高。

1型糖尿病以胰岛β细胞破坏为主的自身免疫性疾病，其发病与人类白细胞抗原（human leukocyte antigen, HLA）复合物等遗传背景密切相关[13]，但是导致1型糖尿病发生的启动因素目前仍未明确，可能包括病毒（肠道病毒、柯萨奇病毒、先天性风疹等）、环境毒素（亚硝胺类）及食物（早期暴露的牛奶、谷物、麸质等）等[14-15]。NK细胞与这些始动因素相关，非肥胖型小鼠模型中胰岛β细胞破坏与病毒感染所致NK细胞依赖的细胞凋亡有关[16]。本研究发现，1型糖尿病患者外周血中NKp44+NK细胞比例增加，同时IL-22水平明显升高，IL-22可来源于NKp44+NK细胞、Th17细胞、Th22细胞及LTi细胞等细胞，研究发现IL-22与NKp44+NK细胞呈正相关，进一步证实NKp44+NK细胞是外周血中IL-22水平升高的重要来源之一[11-12]。本研究发现，NKp44+NK细胞与糖化血红蛋白呈正相关，提示NKp44+NK细胞可能与血糖控制欠佳有关。NKp44+NK细胞与免疫损伤相关[12]，但本研究并未发现NKp44+NK细胞及IL-22与胰岛β细胞破坏相关的谷氨酸脱羧酶抗体及胰岛素相关抗体等指标相关，可能与NKp44+NK细胞主要参与了细胞免疫调控有关[8]。本研究未分析NKp44+NK细胞及IL-22与胰岛功能指标空腹C肽的相关性，其原因与本研究采用的C肽检测试剂盒检测敏感性有关，其C肽下限位于0.01 ng/dl，本研究纳入受试者C肽水平均低于下限值，C肽均无具体数值，因此缺乏相关性分析。

NKp44+NK细胞与糖尿病慢性并发症相关性分析发现，NKp44+NK细胞主要与糖尿病周围神经病变相关。在合并周围神经病变组中NKp44+NK细胞在外周血有核细胞中比例下降。现关于NKp44+NK细胞与糖尿病慢性并发症尤其是周围神经病变的相关性研究尚欠佳。增高的氧化应激水平是糖尿病周围神经发病的重要机制[17]，在终末期肾病患者中氧化应激能够减少NK细胞活化受体的表达NKG2D[18]，推测1型糖尿病患者周围神经病变NKp44+NK细胞表达下调可能也与氧化应激有关。NK细胞能够增加热痛的阈值[19]，合并糖尿病周围神经病变患者NKp44+NK细胞下降可能减少阈值来参与1型糖尿病患者周围神经病变发生，但均需进一步证实。

综上所述，目前发现在1型糖尿病患者外周血中NKp44+NK细胞比例增多，其可能通过增加IL-22的分泌来参与1型糖尿病发病，虽然纳入本研究的样本量偏少，可能会对本研究的结果产生一定程度的影响，但是对于明确1型糖尿病发病机制仍具有参考意义。