HPLC同时测定半夏泻心汤中8种成分

汪 健， 朱 阳， 许 恒， 江国荣， 张露蓉*

(1.南京中医药大学苏州附属医院,江苏 苏州 215000；2.苏州市中医医院，江苏 苏州 215000)

半夏泻心汤由半夏、黄连、干姜、党参、黄芩、炙甘草、大枣7味药材组方而成的经方，是辛开苦降法的典范方药，出自医圣张仲景的《伤寒杂病论》。全方具有清除中焦湿热郁滞，解除脾气郁遏，恢复脾胃升清降浊；同时可甘温补益脾气，以助中焦气化的功效。常用于治疗胃肠运动功能障碍性的消化系统疾病[1]。新近的研究显示半夏泻心汤汤剂对胃肠激素具有调控作用，同时可以改善胰岛素抵抗，临床应用于防治糖尿病前期(Impaired glucose regulation, IGR)及糖尿病(Diabetes, DM)，获得较好的疗效[2]。而且，现代药理学研究也显示半夏泻心汤可调控GLP-1的分泌、增加胰岛素水平、降低血糖等，表明其具备改善高血糖的效应[3-5]。为了进一步研究半夏泻心汤水煎液防治IGR和糖尿病的效应物质及其机理，本文应用高效液相色谱法(HPLC)建立了同时测定半夏泻心汤中8个主要效应成分含量的检测方法，为半夏泻心汤水煎液的质量控制提供标准和检测方法，也为进一步的研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 仪器于试药

1.1.1 仪器 Agilent 1260液相色谱系统(Agilent 1260 四元泵，DAD二极管阵列检测器，全自动进样器，Agilent 1260液相色谱工作站)；PL203电子天平(Mettler-Toledo公司)；GL-16G-Ⅱ型高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)；Heizbad HB digit玻璃旋转蒸发仪(德国Heidolph公司)。

1.1.2 试剂 对照品芦丁(批号：16113006)、黄芩苷(批号：041202)、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(批号：16080301)、汉黄芩苷(批号：17010904)、黄芩素(批号：17012802)、盐酸药根碱(批号：17031002)、大黄素(批号：110756-200110)、汉黄芩素(批号：17012304)，均购自于上海纯优生科技有限公司，色谱纯。水，高纯水；乙腈，色谱纯(西班牙SCHARLAB S.L)；甲醇，色谱纯(无锡市展望化工试剂有限公司)。试验用水为去离子水。

1.1.3 药材 法半夏(批号产地：160430四川)、干姜(批号产地：160506四川)、黄芩(批号产地：160604河北)、黄连(批号产地：160306四川)、党参(批号产地：160321甘肃)、炙甘草(批号产地：160223内蒙古)和大枣(批号产地：160309江苏)七味药材均购自于苏州市春辉堂药业有限公司。经苏州市中医医院研究院江国荣主任鉴定：法半夏为天南星科植物半夏干燥块茎的炮制加工品；干姜为姜科植物干姜的干燥根茎；黄芩干姜为唇形科植物黄芩的干燥根；黄连为毛莨科植物黄连的干燥根茎；党参为桔梗科植物党参的干燥根；甘草为豆科植物甘草干燥根及根茎的炮制加工品；大枣为鼠李科植物枣的干燥成熟果实。

半夏泻心汤水煎液的制备：按照《伤寒杂病论》中的配比(法半夏15 g、黄连3 g，黄芩9 g，炙甘草9 g，干姜9 g，党参9 g，大枣4枚)进行称量，加8倍量冷水浸润30 min，回流提取40 min，趁热过滤上清液。药渣中再加6倍量水，回流提取30 min，趁热过滤上清液。合并两次得到的上清液，减压浓缩至1 g/mL流浸膏冷藏备用。共制备10批次，批号分别为：170509、170510、170511、170512、170513、170514、170515、170516、170517、170518。

1.2 试验方法

1.2.1 混合对照品溶液的制备 精密称取芦丁、黄芩苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷、黄芩素、盐酸药根碱、汉黄芩素、大黄素对照品各1.90、1.98、2.10、2.05、2.16、2.00、0.56、1.96 mg，用甲醇定容至1 mL，即得混合对照品储备液，置于4 ℃冰箱保存。取对照品储备液，用甲醇稀释配制成每1 mL分别含芦丁30.182 μg、黄芩苷45.987 μg、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷56.662 μg、汉黄芩苷61.520 μg、黄芩素69.300 μg、盐酸药根碱35.100 μg、大黄素1.620 μg、汉黄芩素44.100 μg的混合对照品溶液。

1.2.2 供试品溶液的制备 精密量取制备的半夏泻心汤水煎液的浓缩液1 mL，与同体积的甲醇混匀，于12 000 rpm离心10 min，吸取上清液，再重复离心一次，得供试品溶液。

1.2.3 色谱条件 色谱柱：ZORBAX Extend-C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流动相：乙腈(B液)和0.05%三乙胺水溶液(pH 2.1)(A液)如表1所示的梯度条件进行洗脱；流速为1 mL/min ；检测波长为280 nm；柱温为30 ℃，进样量为10 μL。

表1 乙腈-水梯度洗脱表

2 结果与分析

2.1 专属性考察

在1.2.3节下，芦丁、黄芩苷、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、汉黄芩苷、黄芩素、盐酸药根碱、大黄素、汉黄芩素的保留时间分别约为33.5、42.1、54.7、67.6、72.6、85.9、96.6、106.7 min，其它成分对测定无干扰(图1～2)。

图1 供试品

图2 混合标准品

2.2 线性关系考察

取不同浓度的混合对照品，分别以各个成分的对照品质量浓度(X)作为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程(表2)。

表2 各成分的线性关系

2.3 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液，按“1.2.3节方法连续进样6次，每次进样10 μL。记录8个成分的保留时间和峰面积，并分别计算RSD。结果芦丁、黄芩苷、千层纸素、汉黄芩苷、黄芩素、盐酸药根碱、大黄素、汉黄芩素保留时间的RSD分别为0.95%、0.81%、4.60%、4.18%、2.18%、0.81%、0.63%、3.38%；峰面积的RSD分别为4.45%、2.67%、4.64%、2.93%、1.81%、3.59%、4.20%、4.39%，符合色谱图谱的要求，表明精密度良好。

2.4 重复性试验

取6份供试品溶液，按“1.2.3”节方法进样检测分析，并且记录下各个成分的色谱图。结果芦丁、黄芩苷、千层纸素、汉黄芩苷、黄芩素、盐酸药根碱、大黄素、汉黄芩素的保留时间的RSD分别为0.42%、1.35%、1.62%、0.95%、1.464%、0.66%、2.04%、1.04%，峰面积的RSD分别为1.37%、3.28%、1.63%、3.21%、3.66%、4.58%、4.14%、1.61%，符合色谱图谱的要求，表明该试验方法重复性良好。

2.5 稳定性试验

取供试品溶液，按“1.2.3”节色谱条件，在溶液制备后的0、2、4、8、12、24 h进行进样检测分析，记录色谱图。结果芦丁、黄芩苷、千层纸素、汉黄芩苷黄芩素、盐酸药根碱、大黄素、汉黄芩素保留时间的RSD分别为4.21%、3.66%、3.46%、3.13%、1.46%、0.66%、2.04%、1.04%，峰面积的RSD分别为3.58%、4.72%、4.53%、3.03%、3.66%、4.58%、4.14%、1.62%，符合色谱图谱的要求，表明在24 h内，供试品溶液的稳定性良好。

2.6 加样回收率试验

精密吸取已知8个成分含量的半夏泻心汤1 mL，共6份，分别精密加入含有8种成分的混合对照品溶液，按照“1.2.2”节制备供试品溶液，并按“1.2.3”节色谱条件进样检测，计算8种成分的加样回收率，结果芦丁、黄芩苷、千层纸素、汉黄芩苷、黄芩素、盐酸药根碱、大黄素、汉黄芩素的含量分别为95.0%±2.6%、104.0%±1.7%、101.0%±2.2%、98.0%±1.5%、99.0%±2.4%、100.0%±3.9%、102.0%±4.6%、105.0%±4.0%。

2.7 含量测定

取10批半夏泻心汤水煎液的浓缩液，分别按照方法“1.2.2”节制备供试品溶液，并按“1.2.3”节色谱条件进样检测，应用回归方程计算芦丁、黄芩苷、千层纸素、汉黄芩苷、黄芩素、盐酸药根碱、大黄素、汉黄芩素的含量(表3)。半夏泻心汤样品检测显示，8种成分含量分别为2 298.6±2.12、3 644.2±120.45、1 179±34.07、717.9±2.65、61.1±3.37、48.8±2.66、48.07±1.50、2.78±0.24 μg/mL。

表3 样品含量测定结果

续表3

3 结论与讨论

3.1 煎煮溶剂的选择

本试验前期在建立半夏泻心汤的指纹图谱过程中，对比了水、甲醇、乙酸乙酯等不同溶剂提取液的色谱图，结果显示乙酸乙酯提取的成分相对较少，而甲醇和水提取液的出峰数量相差不大，但含量有所差异。考虑目前临床应用的半夏泻心汤是汤剂形式存在的，为了与临床使用相同，故在建立含量检测方法时仍选择水为提取溶剂。

3.2 色谱条件的选择

本文分别采用乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.1%十二烷基磺酸钠、乙腈-0.05%三乙胺水溶液(磷酸调 pH为2.0)进行梯度洗脱分析[6-7]。结果表明，乙腈-0.05%三乙胺水溶液(磷酸调 pH为2.0)梯度洗脱系统有助于各色谱峰的分离[8-9]，出峰数相比其他条件最多，分离度也是最好的。

3.3 波长的选择

本文采用DAD检测器进行 200～400 nm 范围全波长扫描，结果显示半夏泻心汤水煎液在280 nm 检测波长下出峰数最多，8个成分均显示比较好的吸收峰，所以选择280 nm 作为本试验的检测波长。

3.4 效应成分黄连素的检测方法

黄连素是半夏泻心汤中黄连的主要成分，也是目前报道较多具有明显诱导小肠Langerhans细胞合成分泌GLP-1的效应成分。但我们在建立检测色谱分析方法时，发现黄连中生物碱类成分结构相似，HPLC分析出现部分重合或完全重合等现象，在本文建立的方法中没有得到很好的分离。为了更好对半夏泻心汤水煎液进行质量控制，我们在前面8个成分检测的基础上，另采用药典方法对黄连素含量进行单独检测，作为半夏泻心汤质量控制标准的补充检测方法。