细叶石仙桃乙醇提取物自由基清除活性研究

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(1.广西中医药大学药学院，广西 南宁 530001；2.广西南宁市第五十六中学，广西 南宁 530001；3.广西师范学院化学与材料学院，广西 南宁 530001 .)

细叶石仙桃(Pholidota cantonensis Rolfe)是兰科石仙桃属植物，根状茎匍匐，分枝，直径2.5～3.5nm，密被鳞片状鞘，通常相距1-3厘米生假鳞茎，节上疏生根；假鳞茎狭卵形至卵状长圆形，长1～2cm，宽5～8nm，基部略收狭成幼嫩时为箨状鳞片所包，顶端生2叶。花期4月，果期8-9月。产浙江、江西、福建、台湾、湖南、广东和广西。生于林中或荫蔽处的岩石上，海拔200～850m。《滇药录》：全草(假鳞茎)治疮疖红肿疼痛，火灼伤。《彝药志》全草治骨折，关节脱位。人体新陈代谢过程中产生的过量自由基，与动脉硬化、关节炎、糖尿病、肌肉萎缩和老年痴呆等多种疾病相关[1-3]。由于合成的抗氧化剂副作用多，近年来科研工作者致力于寻找来源于植物的天然抗氧化剂[4-5]。细叶石仙桃作为一种常用的草药，其抗氧化方面的研究未见报道。本实验通过冷浸法得到细叶石仙桃乙醇提取物，采用DPPH和羟自由基体系，评估其对自由基清除能力。

1 材料与仪器

UV1901型紫外可见分光光度计(北京普析电子科技有限公司)。细叶石仙桃药材购于广西百色。芦丁标准品购于百灵威试剂公司(北京)。所有试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 细叶石仙桃乙醇提取物制备

称取20 g细叶石仙桃粉末，加入200 mL乙醇(95%)，冷浸72 h。重复上述操作3次，合并提取液。旋转蒸发回收溶剂，得到细叶石仙桃乙醇提取物。

2.2 总黄酮含量测定

2.2.1 标准曲线测定

精密吸取芦丁对照品溶液(l mg/mL)于l0 mL量瓶中，分别加5%亚硝酸钠0.4 mL，静置6min，加入5%硝酸铝0.4mL，静置6min。加5%氢氧化钠试液4.0 mL，用95%乙醇稀释至刻度，摇匀。静置15min，在510nm处测定吸收度。以吸收度对溶液浓度进行回归分析，绘制标准曲线，推出回归方程。

2.2.2 细叶石仙桃乙醇提取物总黄酮含量测定

将芦丁标准溶液换为固定浓度提取物溶液，同上操作测定吸光度，多次测量求平均值。根据标准曲线计算总黄酮的芦丁当量，总黄酮含量以每克干物质的芦丁当量(mg)表示，并计算提取得率。

2.3 二苯基苦味肼基自由基(DPPH)体系[4]

取不同浓度细叶石仙桃乙醇提取物提取物溶液(0.2、0.5、0.8、1.2、1.5、1.8和2.0 mg/mL)加入8 mL DPPH(0.004%)溶液中。在最大波长处(517 nm)测吸光度，直到平衡为止。清除率计算公式如下：S % = (1-A样品)/ A空白 × 100%。其中，A空白为未加药液的DPPH溶液的吸光度，A样品为加入药液的DPPH溶液的吸光度。

2.4 羟自由基体系

以蒸馏水将75 mmo1/L邻二氮菲无水乙醉溶液稀释至7.5 mmol/L，依次往50 mL比色管中加入1.0 mL浓度7.5 mmol/L邻二氮菲溶液，5 mL pH7.4 PBS，1.0 mL FeSO4溶液，一定量的抗氧剂溶液，1.0 mL H2O2应用液，以蒸馏水补充体积至25 mL。37 ℃保温反应60 min，测A510。既加抗氧剂，又加H2O2的为加药管;不加抗氧剂，只加H2O2的为损伤管;未损伤管两者均不加。羟自由基清除率s=[A加药-A损伤)]/[A未损伤-A损伤]×100%。若为负值，则表示此时表现促氧化性；若为正值，则表示此时表现抗氧化性。

3 结果

3.1 细叶石仙桃乙醇提取物总黄酮含量测定结果

以吸收度对溶液浓度进行回归分析，绘制标准曲线，推出回归方程为：y=9.6778x+0.0167(R=0.9992)。根据线性方程得出细叶石仙桃乙醇提取物的总黄酮含量测定结果，其总黄酮含量为39.6 mg/g。细叶石仙桃乙醇提取物具有较高的总黄酮含量。

3.2 细叶石仙桃乙醇提取物对DPPH自由基的清除能力

3.2.1 不同浓度提取物对DPPH自由基的清除能力

图1为不同浓度细叶石仙桃乙醇提取物对DPPH自由基的清除能力。药液浓度为0.2 mg/mL时，提取物对DPPH自由基的清除率为24.8%。药液浓度为0.5和0.8 mg/mL时，提取物对DPPH自由基的清除率分别为48.7%和61.5%，分别为0.2 mg/mL时清除率的1.96和2.48倍。药液浓度为1.8和2.0时，提取物对DPPH自由基的清除率分别为81.6%和83.7%，分别为0.2 mg/mL时清除率的3.29和3.38倍，表明随着药液浓度增加，提取物对DPPH自由基的清除能力迅速增大。

图1 不同浓度细叶石仙桃乙醇提取物 对DPPH自由基的清除能力

3.2.2 不同时间提取物对DPPH自由基的清除能力

图2 不同时间细叶石仙桃乙醇提取物 对DPPH自由基的清除能力(浓度=2.0 mg/mL)

图2列出了不同时间细叶石仙桃乙醇提取物对DPPH自由基的清除率。随着反应时间增加，细叶石仙桃乙醇提取物对DPPH自由基的清除能力增大。将浓度为2.0 mg/mL的提取物加入DPPH自由基时测得DPPH自由基清除率为58.9%，10 min后测得清除率增大至1.27倍，为74.7%。从图2可以看出，反应时间20 min后，DPPH自由基清除率增加较为平缓，反应时间为70 min时的清除率为20 min时清除率的1.07倍。

3.3 细叶石仙桃乙醇提取物对羟基自由基的清除能力

图3表示的是细叶石仙桃乙醇提取物对羟基自由基的清除能力。随着浓度增加，细叶石仙桃乙醇提取物对羟自由基的清除能力迅速增大。浓度为0.2 mg/mL时该提取物对羟自由基的清除率为19.7%，浓度为0.5和0.8 mg/mL时，羟自由基清除率分别增加至1.30和2.09倍，分别为25.6%和41.2%。值得注意的是，浓度为2.0 mg/mL时，羟自由基清除率达到了100%。

图3 细叶石仙桃乙醇提取物 对羟基自由基的清除能力

3.4 细叶石仙桃乙醇提取物对DPPH和羟基自由基的EC50值

细叶石仙桃乙醇提取物对DPPH自由基的EC50值为0.52 mg/mL，对羟自由基的EC50值为0.98 mg/mL。EC50的数值越大，表明抗氧化剂对自由基的清除能力越强。细叶石仙桃乙醇提取物对DPPH和羟基自由基较低的EC50值表明其对DPPH和羟基自由基具有良好的清除能力，这可能与其较高含量的黄酮类物质有关。

4 结论

本实验测定了细叶石仙桃乙醇提取物的总黄酮含量，并采用DPPH自由基体系和羟自由基体系来评估其自由基清除活性。结果表明，细叶石仙桃乙醇提取物对DPPH自由基显示出良好的清除效果，浓度为2.0 mg/mL时清除率为83.7%。同时，该提取物对羟自由基具有优异的清除能力，清除率最高达到了100%。细叶石仙桃乙醇提取物对DPPH自由基和羟自由基的清除率与药液浓度呈正相关性，而该提取物对DPPH自由基清除率也与反应时间有关。细叶石仙桃乙醇提取物具有优异的自由基清除能力，有望作为天然的自由基清除剂应用。