云南竹灵芝中三萜类成分的提取工艺优化

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(1.浙江树人大学 生物与环境工程学院 ,浙江 杭州 310015;2.丽水海关检验检疫综合技术服务中心,浙江 丽水 323000)

灵芝(Ganoderma lucidum)是一种大型药用真菌，属于担子纲多孔菌科灵芝属真菌[1]，始载于《神农本草经》，历代医书均将其列为上品，具有补中益气、延年益寿、扶正固本、滋阴强壮等功效。灵芝中主要含有多糖、三萜、核苷、生物碱、氨基酸多肽、微量元素等化学成分，其中三萜和多糖是灵芝最主要的两大活性成分。竹灵芝是一种生长于云南、海南等地的喜热灵芝(Ganoderma calidophilum)，因常盛产于竹林下富含腐竹叶的地表，民间通常称之为"竹灵芝"。竹灵芝的菌盖呈半圆形或近扇形，颜色为紫褐色或黑褐色，有似漆样光泽，有同心环沟和环纹并有纵皱，边缘钝，直径2.0～4.5 cm，厚0.3～1.0 cm；菌盖背面白色或近白色[2]。菌柄一般背侧生或背生，呈紫褐色或紫黑色，多弯曲，较细，长约5～12 cm，粗0.3～0.8 cm，有光泽。目前关于灵芝的化学成分及药理活性的研究非常多[3-7]，但是针对竹灵芝的展开的研究还非常少，本文选取了云南竹灵芝作为研究对象，对其三萜的提取工艺进行了研究。

1 材料与仪器

无水乙醇、乙酸乙酯、冰乙酸、高氯酸、香兰素(以上试剂均为分析纯)、熊果酸标准品(上海源叶生物科技有限公司)、竹灵芝(市售，采于云南文山)、容量瓶，电子分析天平，可见分光光度计(日本岛津UV-124型)。

2 实验方法

2.1 标准曲线的建立

精确称取5mg熊果酸标准品，用适量乙酸乙酯溶解，定容至50mL。分别移取标准品溶液0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0mL置于具塞试管中，置于90℃水浴中，挥干。再加入0.8mL的5%香草醛-冰乙酸溶液以及2mL的高氯酸溶液，混合均匀后，在65℃恒温水浴中反应15min，冷却至室温，用冰乙酸稀释至10mL，振摇15min后，在波长为548.1 nm处的紫外分光光度计中测其吸光度，记录数据，然后以熊果酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线[8]。

2.2 竹灵芝中三萜成份的提取工艺优化

2.2.1 乙醇浓度对竹灵芝中三萜得率的影响

精确称取1.000g的灵芝子实体粉末4份，分装于4个250mL的锥形瓶中，分别加入30mL 85%、90%、95%、100%的乙醇，在40℃、150W的超声功率下提取20min，冷却到室温后转移至50mL的容量瓶中，加乙醇定容至50mL，摇匀并过滤，吸取滤液1mL于25mL比色管中，与此同时参比比色管中加入1 mL 100%乙醇，按标准曲线相同的方法进行反应，测定反应液在548.1nm处的吸光度，计算三萜的得率。

2.2.2 不同料液比对竹灵芝中三萜得率的影响

精确称取1.000g的灵芝子实体粉末4份，分装于4个250mL的锥形瓶中，依次按料液比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30加入95%乙醇，在40℃、150W的超声功率下提取20min，冷却到室温后转移至50mL的容量瓶中，加乙醇定容至50mL，摇匀并过滤，吸取滤液1mL于25mL比色管中，与此同时参比比色管中加入1mL100%乙醇，按标准曲线相同的方法进行反应，测定反应液在548.1nm处的吸光度，计算三萜的得率。

2.2.3 提取温度对竹灵芝中三萜得率的影响

精确称取1.000g的灵芝子实体粉末4份，分装于4个250mL的锥形瓶中，各加入30mL 95%乙醇，分别于40℃、50℃、60℃、70℃，150W的超声功率下提取20min，冷却到室温后转移至50mL的容量瓶中，加乙醇定容至50mL，摇匀并过滤，吸取滤液1mL于25mL比色管中，与此同时参比比色管中加入1mL100%乙醇，按标准曲线相同的方法进行反应，测定反应液在548.1nm处的吸光度，计算三萜的得率。

2.2.4 提取时间对竹灵芝中三萜得率的影响

精确称取1.000g的灵芝子实体粉末4份，分装于4个250mL的锥形瓶中，各加入30mL 95%乙醇，于40℃、150W的超声功率下分别提取20，30，40，50min。冷却到室温后转移至50mL的容量瓶中，加乙醇定容至50mL，摇匀并过滤，吸取滤液1mL于25mL比色管中，与此同时参比比色管中加入1mL 100%乙醇，按标准曲线相同的方法进行反应，测定反应液在548.1nm处的吸光度，计算三萜的得率。

2.2.5 正交实验

依据上述单因素实验的结果，以乙醇浓度(A)、料液比(B)、浸提温度(C)、提取时间(D)为自变量，以灵芝三萜得率为评估指标，设计L9正交实验，考察各实验参数对灵芝中三萜得率的影响。再使用最佳提取条件，进行三次平行试验，测试提取工艺的稳定性。

3 结果和分析

3.1 熊果酸的标准曲线

将测得的吸光度对熊果酸溶液的浓度进行线性回归分析，得出回归方程为y=1.9938x-0.0129，R2=0.9978，表明熊果酸溶液在0.02至0.2 mg/L之间与吸光度线性关系良好，实验结果见图1。

图1 熊果酸浓度与吸光度之间的关系

Fig.1 Relationship between ursolic acid concentration and the absorbance

3.2 乙醇浓度对竹灵芝中三萜得率的影响

实验结果见图2，总体来讲，随着乙醇的浓度不断提高，竹灵芝中三萜类化合物的提取效果越来越好。当乙醇浓度为90%时，灵芝三萜得率仅为0.260%；而当乙醇浓度为100%时，灵芝三萜类化合物提取得率最高，为1.070%，可能原因为三萜类化合物的极性普遍较小，随着乙醇浓度的增加，提取液极性降低，更加容易溶解出灵芝三萜。

图2 不同提取条件与三萜得率之间的关系

Fig.2 the extraction yield of triterpenoids under different extraction conditions

3.3 不同料液比对竹灵芝中三萜得率的影响

随着提取溶剂的用量不断增加，灵芝中提取得到三萜类化合物的得率不断提升，料液比超过1∶25后，三萜类化合物的得率增加趋于平缓，甚至略微下降。考虑到溶剂的利用率及经济价值等问题，料液比1∶25是较优的提取料液比。

3.4 不同温度对竹灵芝中三萜得率的影响

当其它条件一定时，随着温度的增加，灵芝三萜的提取效果先增加后降低，在50℃时有相对较好的提取效果，提取得率达到了1.050%。可能是由于随着提取温度升高，分子运动变得更加激烈，从而加快了分子的运动，同时溶剂向灵芝内部更好地渗透，促进了有效成分在试剂中的溶出，有利于细胞内三萜类化合物的浸出。当提取温度超过50℃后，灵芝三萜的提取得率随着浸提温度的上升反而下降，其原因可能是因为温度开始接近乙醇的沸点，导致乙醇的挥发量越来越大，从而导致了灵芝三萜的提取得率急剧下降。

3.5 不同提取时间对竹灵芝中三萜得率的影响

随着超声提取时间的增加，灵芝中三萜类物质的提取得率先上升再下降，在30min时达到最高，提取得率达到了1.080%，而超过30min后，随着超声时间的增加，三萜类化合物的提取得率反而降低，怀疑是长时间的超声处理破坏了灵芝中三萜类化合物的结构，从而降低了灵芝三萜类化合物的提取得率。

3.6 正交实验

在单因素试验结果的基础上，本实验以三萜类化合物的提取得率为检测指标进行正交试验，选取了乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间等四个因素，设计了4因素3水平的正交实验，因素水平见表1，试验结果见表2。

表1 正交试验因素水平表Tab.1 Factor level of orthogonal experiment

表2 正交试验结果表Tab.2 Orthogonal experiment chart and result

由表2进行极差分析可知，提取工艺参数对灵芝三萜类化合物提取得率的影响程度大小依次为：提取时间(D)>乙醇浓度(A)>浸提温度(C)>料液比(B)，其中影响最大的是提取时间，影响最小的是料液比。最佳提取工艺条件应选择A1B1C1D1，提取得率为1.758%，即选择100%的乙醇浓度，1∶20的料液比，40℃的浸提温度，20min的提取时间。

3.7 验证实验

在上述最佳提取条件下，即100%的乙醇浓度，1∶20的料液比，40℃的浸提温度，20min的提取时间条件下，进行灵芝中三萜类化合物的提取试验，并进行3次平行实验，分别测定灵芝三萜类化合物的提取得率，结果见表3。从表3可知该最佳试验方案所测定的灵芝三萜类化合物提取得率均优于其它试验方案，且重复性较好，表明该提取方法稳定可靠。

表3 最优提取条件下灵芝三萜提取得率的平行试验

4 结论

(1)以熊果酸作为标准物质，在浓度0.02至0.2 mg/mL范围内反应产物与吸光度之间线性关系良好。

(2)以无水乙醇作为溶剂，在超声辅助的情况下对云南竹灵芝中的三萜类化合物进行提取，单因素实验结果表明：随着乙醇浓度的增加，三萜类化合物的得率快速增加；随着料液比增加，三萜类化合物的提取得率先增加再趋于平缓；随着提取温度的升高，提取得率先增加后减少，在50℃附近有最好的提取效果；随着提取时间的增加，灵芝三萜提取得率先提高后降低。

(3)正交实验的极差分析表明实验条件中，各因素对提取得率的影响为提取时间(D)>乙醇浓度(A)>浸提温度(C)>料液比(B)，由正交实验结果得出最佳提取工艺条件为100%的乙醇浓度，1∶20的料液比，40℃的浸提温度，20min的提取时间。在该条件下对云南竹灵芝中的三萜类物质进行三次提取，三萜的得率平行性较好，且均高于单因素实验及正交实验中的任何一次单独的实验，平均得率达到了1.757%。表明通过正交实验得到的实验条件提取效果较好，其平行性也非常好。