HPLC法同时测定复方三维右旋泛酸钙糖浆中党参炔苷和枸橼酸的含量

任强强 ，许 文 ，黄鸣清 ，叶水国 ，苏志伟

（1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；2.福建省中药学重点实验室，福建 福州 350122；3.国药控股星鲨制药（厦门）有限公司，福建 厦门 361028）

复方三维右旋泛酸钙糖浆，原名维他肥儿膏或维力膏，收载于化学药品地标升国标第10册药品标准，其主要成分由维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酰胺、泛酸钙5种B族维生素和10味中药（党参、焦白术、茯苓、炒薏苡仁、芡实、山药、山楂、焦麦芽、莲子、炒扁豆）复方提取物组合而成，其中复方中药流浸膏在制剂中的含量为0.053 96 mL／g，是一种以中药为主的健脾胃中西复方制剂，其主治功能为“补中益气，健脾止泻，消食导滞”，用于小儿脾胃虚弱、体倦神疲及小儿病后调理的滋补营养剂，尤其适用于小儿营养不良及维生素缺乏症［1］。

方中党参扶脾益胃、补中益气，为补气健脾之要药，同时也是方中的君药；山楂为健脾开胃、消食化滞的良药，同时为方中佐药。中国药典2015年版以党参炔苷为对照，对党参药材进行薄层鉴别评价。现代药理研究表明聚炔类成分有明显的抗菌、杀菌、抗炎、抗癌、免疫力抑制及酶抑制的生物活性［2］。党参炔苷除这些药理作用外，亦有通过影响卵巢颗粒细胞增殖分化而影响生殖系统的作用［3］，常作为党参的指标性成分［4-5］，也是其功效的药效物质基础。研究表明党参炔苷具有抗胃黏膜急性损伤的作用，与党参补中益气的传统功效相符，为党参胃黏膜保护作用的活性成分［6］，因此是复方三维右旋泛酸钙糖浆的重要活性成分。山楂中的有机酸被认为是消食健脾的有效成分［7］，有助消化、促进胃肠运动、调节血脂和预防肿瘤的作用，是促消化功能的主要药效部位［8-9］，并且其有机酸类物质以枸橼酸含量最高，可达 17.50 mg／g［10］，中国药典 2015 年版也以枸橼酸作为山楂有机酸总量测定的指标成分。因此，党参炔苷和枸橼酸的含量测定可作为该制剂质量控制环节的重要指标成分。

目前，关于复方三维右旋泛酸钙糖浆中化学成分的测定已有文献报道［11-12］，但是均未涉及到制剂中中药成分的含量测定，难以全面反映复方三维右旋泛酸钙糖浆复方制剂的质量。为了更全面地控制该制剂的质量，本研究建立高效液相色谱法对复方三维右旋泛酸钙糖浆中党参炔苷和枸橼酸的含量进行同时测定，为制剂的质量评价体系提供更有力的依据，确保其在临床方面的疗效。

1 仪器与试药

Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国Agilent Technologies公司），包括 G1311C四元泵、G1329B自动进样器、G1315B二极管阵列检测器、G1316A柱温箱和Agilent ChemStation工作站；CPA225D型十万分之一分析天平（德国Sartorius公司）；Milli-Q超纯水仪（美国Millipore公司）。10个批次复方三维右旋泛酸钙糖浆均来源于国药控股星鲨制药（厦门）有限公司。对照品党参炔苷（批号：111732-201607）和枸橼酸（批号：100396-201603，含量为100.0%）购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈为色谱纯（德国MERCK公司）；磷酸（上海西格玛奥德里奇贸易有限公司）；甲酸、乙酸为色谱纯（上海阿拉丁试剂有限公司）；磷酸二氢铵为分析纯（广东西陇科学股份有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Phenomenex Luna C18（2）（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-0.01 mol·L-1NH4H2PO4（含 0.03%H3PO4）水（B）溶液，等度洗脱（0～10 min，10%A）；流速：1.0 mL／min；检测波长：210 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。 在上述色谱条件下，对照品与样品的色谱图见图1。

图1 对照品、供试品和阴性样品的HPLC色谱图

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品储备液制备 精密称取党参炔苷和枸橼酸的对照品适量，分别置于25 mL量瓶，纯甲醇稀释至刻度，得单一对照品母液，质量浓度分别为 686、546 μg／mL。分别取党参炔苷和枸橼酸对照品母液适量，共同置于5 mL量瓶中，用10%甲醇溶解并稀释到刻度，摇匀，得到质量浓度为274.4、218.4 μg／mL的混合对照品储备液。

2.2.2 供试品溶液制备 取复方三维右旋泛酸钙糖浆5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，移液管移入超纯水15 mL，振摇20 min至完全溶解，移入25 mL量瓶，锥形瓶用超纯水润洗3次，洗液并入量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，过0.45 μm滤膜，取续滤液，即得供试品溶液。

2.2.3 阴性对照溶液制备 分别取缺党参和山楂的复方三维右旋泛酸钙中药复方处方，按照复方三维右旋泛酸钙中药复方中间体制备过程提取浓缩，并加入相关辅料制备成阴性糖浆样品，取阴性样品5 g，按“2.2.2”项下方法制备阴性对照溶液。

2.3 专属性实验 取“2.2.3”项下阴性对照溶液，在“2.1”项色谱条件下测定，发现阴性无干扰，具体见图 1。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 取“2.2.1”项下方法制备的各对照品储备液，用10%甲醇稀释，配成党参炔苷质量浓度分别为 10.976、16.464、34.3、68.6、137.2、274.4 μg／mL，枸橼酸质量浓度分别为 8.736、13.104、27.3、54.6、109.2、218.4 μg／mL 的系列混合对照品溶液。按“2.1”项下色谱条件进行分析，以质量浓度X为横坐标，以峰面积均值Y为纵坐标，进行回归处理，得到2个分析物的回归方程。以信噪比（S／N）10∶1为基准测得各化合物的定量限，结果见表1。

表1 线性关系及定量限

2.4.2 精密度试验 取同一浓度混合对照品溶液（党参炔苷和枸橼酸的质量浓度分别为68.6、54.6 μg／mL），按“2.1”项下色谱条件进行分析，1 d 内连续进样6次，测得方法的日内精密度；连续测定3 d，每天进样测定6次，计算日间精密度。党参炔苷和枸橼酸日内峰面积的RSD值分别为1.30%、1.31%，日间峰面积的RSD值分别为1.58%、1.61%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性试验 取同一样品的供试品溶液（编号为 S3），分别在制备后 0、2、4、8、12、24 h 按“2.1”项下色谱条件进行分析，记录党参炔苷和枸橼酸的峰面积，计算得峰面积的RSD值分别为1.03%和0.50%，表明供试品溶液在制备后24 h内稳定。

2.4.4 重复性试验 取同一批次样品（编号为S3），按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行分析，分别测得党参炔苷和枸橼酸平均含量分别为0.086 87和1.066 mg／g，含量的RSD值分别为1.24%和0.80%，结果表明方法重复性良好。

2.4.5 加样回收率试验 精密量取重复性实验同批复方三维右旋泛酸钙糖浆2.5 g，每3份加入相同量（分别为已知含量的80%、100%、120%）的党参炔苷和枸橼酸对照品溶液，按“2.2.2”项下方法制备供试溶液，进样测定，计算各待测成分的加样回收率，结果见表2。

表2 加样回收率试验结果（n＝9）

2.5 样品测定 取10批复方三维右旋泛酸钙糖浆，分别精密称取约5 g样品，每批平行3份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按上述“2.1”项下色谱条件进样10 μL测定峰面积，根据标准曲线计算其含量，结果见表3。

3 讨 论

3.1 色谱柱的选择 本研究测定党参炔苷和枸橼酸的含量，尝试考察了4种不同型号色谱柱，分别为ZORBAX SB-C18（4.6×150 mm，5 μm）、ZORBAX Bonus-RP（4.6×250 mm，5 μm）、Thermo BETASILC18 Analytical（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Phenomenex Luna C18（2）（4.6 mm×250 mm，5 μm），预实验结果表明：ZORBAX SB-C18色谱柱只检测到待测成分枸橼酸；ZORBAX Bonus-RP色谱柱对两种待测成分均有检出，但各待测成分色谱峰拖尾严重；采用Thermo BETASIL C18色谱柱时，两种待测成分出峰靠前且分离度较差；而 Phenomenex Luna C18（2）色谱柱对党参炔苷和枸橼酸的测定均有较好的分离度且达到基线分离，可能是该色谱柱测定的pH范围在1.5～10，pH范围较广且通用性好，对多数化合物均有较好的保留能力。

表3 复方三维右旋泛酸钙中党参炔苷和枸橼酸含量测定结果（mg／g，n＝3）

3.2 流动相系统的优化 对于流动相的筛选，首先比较了甲醇和乙腈两种有机相体系，结果显示甲醇体系要优于乙腈体系；然后进一步考察甲醇体系下不同酸水对色谱分离的影响，包括0.1%甲酸、0.1%乙酸、0.01%磷酸和 0.01 mol／L NH4H2PO4（含0.01%H3PO4），结果表明单一酸水相条件下有机酸的色谱峰会出现宽峰或峰形不对称的情况，而甲醇-0.01 mol／L NH4H2PO4（含 0.01%H3PO4）体系均能达到检测效果，两种待测成分分离效果最优。本实验也考察了磷酸二氢铵酸水相不同浓度及含酸量，比较了0.01、0.02 mol／L两种浓度磷酸二氢铵及含0.01%、0.02%、0.03%和0.05%磷酸的不同含酸量，结果显示高浓度磷酸二氢铵会造成枸橼酸色谱峰分离度较差情况且易损害分析仪器，低含酸量（0.01%、0.02%）时枸橼酸色谱峰出现裂峰且分离度较差，高含酸量（0.05%）时枸橼酸色谱峰出现宽峰，而0.03%含酸量时两种待测成分出峰及各项指标最优，从而选择 0.01 mol／L NH4H2PO4（含 0.03%H3PO4）组成的酸水相。

3.3 测定波长的选择 检测波长直接影响待测物质的信号产生及大小，比较不同波长下的色谱图得出：党参炔苷的吸收范围为210～270 nm，响应值先降低后增加再降低，但增加趋势阶段的最大响应值仍小于210 nm处的响应值，最大吸收在210 nm；枸橼酸的吸收范围为210～250 nm，响应值逐渐降低，最大吸收在 210 nm。有文献［13-14］报道：党参炔苷的检测波长往往选择270 nm左右，枸橼酸的检测波长为210 nm。但在本实验中270 nm波长下枸橼酸响应值很低，综合两种检测成分响应值的高低及阴性干扰的大小，最终采用210 nm的波长检测，此时两种待测成分响应值较高，基线平稳且检识良好。

3.4 样品测定结果 本实验对10个批次的复方三维右旋泛酸钙糖浆中党参炔苷和枸橼酸进行含量测定，党参炔苷的含量范围为0.084 26～0.109 60 mg／g，枸橼酸的含量范围为 0.930 7～1.292 0 mg／g。经统计，10个批次复方三维右旋泛酸钙糖浆中党参炔苷和枸橼酸含量的平均值分别为0.097 80、1.114 5 mg／g，不同批次复方三维右旋泛酸钙糖浆之间党参炔苷和枸橼酸的含量差异较小。

综上，本文建立了HPLC法同时测定复方三维右旋泛酸钙糖浆中党参炔苷和枸橼酸成分的定量分析方法，该方法简便、准确、重复性好，适用于制剂中党参炔苷和枸橼酸的含量测定，为其质量控制提供实验依据。