急性低压低氧环境下富氧干预对大鼠认知功能及海马CA1区形态学的影响

阮俊勇，雷涛，董旭，翟明明，罗二平

1. 空军军医大学 军事生物医学工程学系 军队卫生装备教研室，陕西 西安 710032

2. 海军青岛第一疗养院 器材科，山东 青岛 266071

引言

医学上的高原是指能引起明显生物学效应的海拔3000 m以上的广泛地区，是高原病的多发地区[1]。根据波义耳定律可知，气体体积与压强成反比，随着海拔高度的增加，压强会降低，空气体积会变大，而空气中氧气浓度始终保持不变 [20.9% (V/V)]，所以随着海拔高度的增加，单位体积空气中氧的含量会逐渐减少，从而引发高原缺氧问题。正常成年人脑重占体重2%左右，但其耗氧量却达到了全身耗氧量的20%，而且脑组织的代谢主要以高耗氧的有氧代谢为主，对缺氧十分敏感[2-3]，因此，在高原低氧环境下，高级神经活动的改变往往出现的较早且较为明显。作为大脑边缘系统的组成部分，海马区主要负责记忆的存储转换、信息巩固和空间定向等功能，在认知功能中发挥关键性作用[4]，而海马区对低氧有选择性易感性[5]。因此研究低氧环境下富氧干预对海马结构以及认知功能的影响很有必要。同时，大量文献表明[6-9]，睡眠有助于长时程增强的形成，进而促进记忆（尤其是空间记忆）的巩固，因此我们主要对低氧大鼠在睡眠期间进行富氧干预。本研究采用小型动物实验用环境模拟舱模拟高原环境，使用膜法氧气机结合独立通气笼盒（Individual Ventilated Cages，IVC）提供富氧干预，针对急性低压低氧环境和富氧干预对SD大鼠认知功能及海马体的影响进行研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本实验采用健康SPF级雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠30只，7周龄左右，体重（211.40±18.58）g，均由空军军医大学动物实验中心提供。领取大鼠后在实验室饲养3 d适应环境，实验室明暗交替为12 h:12 h，采用空调24 h通风，温度控制在20℃左右，相对湿度控制在40%～70%，保证饮水充足，在保证不断食的情况下每次给食之间不出现剩余。

1.2 实验仪器

实验所用小型动物实验用环境模拟舱由空军军医大学军事生物医学工程学系与苏州市利安特医疗设备有限公司联合研制，该设备舱体为钢化玻璃，便于观察记录舱内实验过程，通过交替继电器控制两个真空泵以1 h为周期轮换工作对舱体进行抽气，设置粗调、微调两个气源调节阀调整舱体进出气比例以达到模拟高原低压低氧环境，装配有指针式压力表和控制显示面板双重监测舱体内压力[10]，内置温湿度监测显示仪。

实验所用便携式膜法氧气机是由空军军医大学军事生物医学工程学系军队卫生装备教研室自主研制，主要由风机、过滤网、真空泵、富氧膜组件和气体缓冲室组成，根据膜法富氧技术，以空气为原料，真空泵产生负压使空气通过富氧膜组件后得到富氧空气[11]，富氧浓度为（30%±3% V/V），流量为（6±1）L/min。课题组通过大量模拟高原环境与高原地区实地测试发现，该氧气机能显著改善急进高原人群心率、血氧饱和度、PWC170、抗氧化应激能力等一系列生理指标，能够有效提高急进高原人群的抗缺氧能力，极大减少高原反应的发生[12-15]。

实验所用上海移数信息科技有限公司生产的Morris水迷宫系统可以自动监测、记录、分析动物行为实验过程，水池直径为2 m，水深0.5 m，分为四个象限，平台设置在水下2 cm，并用食物色素染黑水池便于记录白色大鼠行为轨迹及掩盖平台。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组

对30只SD大鼠编号后采用随机数字表法完全随机分为三组：平原对照组（NC组）、低压低氧组（LO组）、低压富氧组（HO组），每组10只。

1.3.2 定位航行训练

正式开始实验前一天，让大鼠适应性游泳2 min（取下平台），以适应实验环境，然后对三组大鼠同时进行为期5天的获得性定位航行训练，每只大鼠每天训练4次，每次训练最长时间为1 min，记录大鼠找到并爬上平台的潜伏期（逃避潜伏期），如果1 min后仍未找到平台，则引导其到达平台并站立10 s，每天训练结束后擦拭烘干大鼠身上水分后放归实验室继续饲养。第6天将大鼠按分组进行不同条件干预。

1.3.3 模拟高原环境及富氧干预环境的建立

利用小型动物实验用环境模拟舱模拟海拔6000 m建立缺氧环境，利用便携式膜法氧气机结合IVC笼盒建立富氧环境，在海拔6000 m时笼盒内氧气浓度为28.4%（上下浮动不超过0.5%），同时在富氧笼盒内放置CO2吸附剂，控制CO2浓度在5%以下。定位航行训练结束后将LO组置于低压舱内、将HO组置于低压舱内的富氧笼盒内、将NC组置于低压舱外进行饲养。其中富氧组每天富氧时间为12 h，其余时间饲养于低压舱内，考虑到大鼠昼伏夜出，富氧干预设置在白天，主要模拟高原人群睡眠时间进行富氧干预。保证三组大鼠食水充足，定时更换垫料。

1.3.4 空间探索能力测试

分组干预3 天以后分别测试三组大鼠空间探索能力，将Morris水迷宫内水下平台撤去，选择目标平台两侧象限将大鼠分两次放入水池，记录2 min内大鼠穿越平台次数，计两次穿越平台次数平均值作为空间记忆能力指标，实验过程如图1a所示。

1.3.5 大鼠海马CA1区病理观察

空间探索测试结束之后立即对大鼠进行10%水合氯醛麻醉，冰上取海马组织，浸泡于4%甲醛溶液内，待完全固定后，使用不同浓度乙醇进行梯度脱水后用石蜡包埋，采用苏木精—伊红染色（HE染色）后，在光镜下观察其病理改变。每组选取5个400倍CA1视野进行拍照并记录变性锥体细胞数。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 空间探索能力

空间探索实验（图1a）结果显示，LO组大鼠穿越平台次数（2.55±0.64）显著低于 NC 组（6.75±0.95）（P＜0.05）和HO组（6.20±0.79）（P＜0.05），HO组和NC组间差异无统计学意义（P＞0.05），见图1b。

图1 Morris水迷宫和穿越平台次数统计

2.2 脑组织病理形态学改变

大鼠海马CA1区HE染色结果，见图2a，可以看出NC组海马锥体细胞形态规则，排列整齐密集，胞核大而圆，染色呈均匀淡蓝色或蓝色，核仁清楚，细胞质丰富，层次及细胞线清晰。LO组海马锥体细胞排列散乱，胞核体积缩小，染色加深，与胞质界线不清，出现大量空泡样变。HO组海马锥体细胞结构损伤显著减轻，排列方式相对整齐，与NC组对照无显著差异。每组选取5个400倍CA1视野进行拍照并记录变性锥体细胞数，统计学分析结果显示，模拟6000 m海拔高原环境LO组海马CA1区锥体细胞变性数（73.60±19.79）明显多于 NC 组（3.80±2.39）（P＜0.05）和HO组（3.40±3.21）（P＜0.05），HO组和NC组间差异无统计学意义（P＞0.05），见图2b。

图2 海马CA1区HE染色典型性光镜照片和椎体细胞变异数统计

3 讨论

高原地区自然环境特殊，昼夜温差大、紫外线辐射强、干燥等气候特征都会对急进高原人群造成一定的影响，但属低氧带来的各种急慢性高原反应对人体健康威胁最大。加上随着交通的日益便利，人们进入高原的节奏大大加快，因此研究急性低压低氧环境对人体脑—体功效方面的影响以及寻找可靠有效的应对措施就显得尤为重要。大量研究表明，急性低压低氧环境会对动物海马组织造成一定的病理改变，并引起其空间学习和记忆等认知功能损伤，严重时可导致脑死亡[16-18]。付中伟等[19]将20只SD大鼠随机分为平原对照组和模拟6000 m海拔低氧暴露7 d、每天暴露12 h，结果发现低氧组大鼠穿越平台次数明显小于对照组（P＜0.05）。史清海等[20]将56只SD大鼠随机分为平原对照组和模拟6000 m海拔低氧暴露2、4、6、8、10、12 d组，之后对各组进行Morris水迷宫定位航行训练和空间探索测试，结果发现各低氧组大鼠穿越平台次数均显著少于对照组（P＜0.05），且低氧暴露2 d组穿越平台次数最少。是文辉等[21]将50只SD大鼠随机分为常压对照组和模拟5000 m海拔急性低压低氧暴露1、2、3、7 d组，结果发现暴露3 d组大鼠脑组织病理学改变最为显著，但随着暴露时间的延长，这种损伤程度会有所降低，这可能和低氧习服机制有关。

我们的实验结果在低氧组的趋势与上述研究具有一致性。更重要的是我们发现Morris水迷宫空间探索测试结果表明，模拟6000 m海拔高度急性低压低氧暴露会导致大鼠空间记忆功能障碍，而采用膜法氧气机在睡眠期间进行富氧干预能显著减轻低氧带来的认知功能损伤。进一步分析海马形态结构可知，低氧组大鼠海马CA1区椎体细胞变性数量显著增加，而富氧组与平原对照组无显著差异。这说明在急性低压低氧环境下采用膜法氧气机进行富氧干预能有效减轻低氧对神经系统的结构损伤，从而在一定程度上保证了其能完成正常的学习记忆等认知功能。当然，低氧导致认知功能障碍的原因错综复杂，而富氧干预带来的改善也不止于此，本实验仅探索到其中的一小部分，还需要进行更加深入地研究。

4 结论

以往解决高原缺氧问题的相关研究大多集中在药物治疗方面，而随着便携式膜法氧气机的成熟和普及，很快就以其使用便捷、见效快、无副作用、人群普遍耐受等优势备受欢迎，对膜法氧气机的应用研究也越来越多。本文通过研究模拟急性低压低氧环境对大鼠认知功能的弱化以及海马CA1区病理改变，确定采用膜法氧气机进行富氧干预能有效保护其海马神经元细胞，并使其认知功能显著提高甚至达到平原水平，为膜法氧气机的应用效果提供了有效实验依据，也为下一步进行人体实验奠定理论基础。