视黄醇结合蛋白测定试剂盒产品技术审评要点

胡燕娴 潘莹 季芳 郭嘉杰 许广宁 苏永梅 孙晋红 康涛 邵秀稳 广东省药品监督管理局审评认证中心 （广东广州 510080）

内容提要：视黄醇结合蛋白测定试剂盒体外定量测定人体样本中视黄醇结合蛋白的含量，临床上主要用于肝脏或肾小管损伤性疾病的辅助诊断。基于《体外诊断试剂注册管理办法》及标准体系等法规指南文件的要求，文章分析该产品在技术审评过程中应关注的要点，以期帮助注册申请人更好地把握注册申报的要求。

视黄醇结合蛋白（Retinol Binding Protein，RBP）为一种小分子蛋白质，是维生素A及其衍生物的特异转运蛋白，分子量仅为21kD。RBP由肝脏合成，广泛分布于血清、尿液、脑脊液及其他体液中。在血液中，RBP与视黄醇、前白蛋白以1:1:1（mol）的复合物形式存在，转运体内90%的视黄醇至身体组织，当RBP与细胞表面的RBP受体结合时，视黄醇进入细胞内，复合物解体，游离的RBP（＜10%）由于可自由通过肾小球膜[1]。但原尿中99%的RBP被近曲小管上皮细胞重摄取并分解供组织利用，仅微量从尿液排泄。正是由于肾小球的重吸收作用，患者尿液中RBP浓度升高，提示近端肾小管损伤或功能受损，有助于肾脏疾病的辅助诊断[2]。近年来，RBP检测及临床应用日益受到关注，检测血和尿液中RBP的浓度，对肾脏、肝脏及营养状况等疾病的诊断和治疗有着重要意义[1,3,4]。

临床检测RBP的方法较多，如免疫比浊法、免疫电泳法、酶联免疫吸附法和放射免疫分析法等，其中，免疫比浊法因其测定方法快速简便、自动化程度高在临床上广泛应用[1]。基于《体外诊断试剂注册管理办法》及标准体系等法规指南文件的要求，本文总结分析了视黄醇结合蛋白测定试剂盒（免疫比浊法）注册申报中相关重要技术文件的审评要点。

1.适用范围

本文所述试剂盒是指适用于分光光度计或生化分析仪用免疫比浊法（如免疫透射比浊法、免散射比浊法、胶乳增强免疫比浊法等）测定血清和/或尿液样本中RBP的试剂盒。根据《6840体外诊断试剂分类子目录（2013版）》，视黄醇结合蛋白检测试剂的管理类别为二类，分类代码为6840。

2.检验原理与产品命名

2.1 检验原理

利用免疫比浊法测定RBP时，应区分散射法和透射法。适量的抗人RBP多或单克隆抗体与样本中RBP通过抗原-抗体反应特异性结合，形成不溶性免疫复合物微粒，使反应液浊度改变，在一定条件下（如570nm波长处），浊度的高低与免疫复合物微粒数即RBP含量呈正相关，可由同样处理的校准品所作的剂量—反应曲线算出。

胶乳增强免疫比浊法即是将待测物质相对应的抗体包被在高分子胶乳颗粒上，当包被有抗体的胶乳颗粒与抗原后，在短时间内迅速聚集在一起，光通过之后，透射光和散射光的强度变化更为显著，从而提高检测的敏感性。

2.2 产品命名

产品通用名称由三部分组成：被测物名称、用途、方法或原理，名称中不应当出现样本类型及定量等内容。根据不同检测原理，产品命名举例为“视黄醇结合蛋白测定试剂盒（免疫透射比浊法）”“视黄醇结合蛋白测定试剂盒（胶乳增强免疫比浊法）”等。

3.产品技术要求

根据《医疗器械产品技术要求编写指导原则》的要求，对于体外诊断试剂产品，检验方法中还应明确采用的参考品/标准品及样本的制备方法、使用的试剂批次和数量、试验次数、计算方法。性能指标不应低于行业标准YY/T 1584-2018《视黄醇结合蛋白测定试剂盒（免疫比浊法）》的要求。测定血清、尿液的RBP试剂盒的性能指标及检验方法不完全相同，技术要求应结合适用的样本类型进行制定。为保证企业制定的技术要求检验方法具有可重现性和可操作性，下面对行业标准中未做明确规定的条款或检验方法进行细化和补充。

3.1 试剂空白吸光度

检测方法明确具体测试次数，若多次测试，则均值为空白吸光度，同时明确空白样本为纯化水或生理盐水或零校准液等。空白吸光度应符合企业规定的要求，可参考已上市同类产品进行制定。

3.2 准确度

采用相对偏差法评价准确度时，应考虑有证参考物质或其他公认的参考物质的选择。有证参考物质（CRM）是指附有证书的参考物质，其一种或多种特性值用建立了溯源性的程序确定，使之可溯源到准确复现的表示该特性值的测量单位，每一种出证的特性值都附有给定置信水平的不确定度[5]。国际约定校准品/参考物质、国家标准品/参考物质通常附有证书，可被定义为有证参考物质。

3.3 线性

线性下限原则上不应为零，至少大于空白吸光度对应的浓度，不小于检出限（LoD）或定量限（LoQ）。检测方法应明确具体的浓度个数，浓度涵盖线性范围，配制适当的浓度点，低浓度样本不宜为零浓度样本（如稀释液）。

3.4 校准品或质控品（如有）

如试剂盒注册单元中包含校准品或质控品，其性能指标的检验方法应在技术要求中予以描述。至少应包括外观、装量、准确性、均匀性、稳定性。干粉或冻干品应包含批内瓶间差、复溶稳定性。

样本背景信息应清晰，样本来源应可追溯。选择涵盖预期用途和干扰因素（如高脂、溶血、黄疸的样本、类风湿因

4.参考区间确定资料

应当详细说明参考区间确定所采用的样本来源、确定方法或依据及详细的试验资料。据报道，血清RBP参考值为25～70mg/L，尿液为0.7mg/L以下，不同样本之间的参考区间明显不同，应分别建立参考区间，研究各样本例数不低于120例[2]。建议参考CLSI EP28-A3c《Defining，Establishing，and Verifying Reference Intervals in the Clinical Laboratory》或WS/T 402-2012《临床实验室检验项目参考区间的制定》进行相应研究。

5.临床评价资料

视黄醇结合蛋白测定试剂盒属于《免于进行临床试验的体外诊断试剂目录（修订）》，申请人可依照《免于进行临床试验的体外诊断试剂临床评价资料基本要求（试行）》开展评价。如无法或不适于按照上述要求对产品进行临床评价，则应按照《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》的要求开展临床试验。下面仅对临床评价中的基本问题进行阐述。

5.1 研究方法

检测RBP目前没有公认的参考方法，临床评价时可选择境内已批准上市、临床普遍认为质量较好的同类产品作为对比试剂，采用待评价体外诊断试剂（以下称考核试剂）与之进行比较研究试验，证明两者具有等效性。

5.2 对比试剂的选择

选择对比试剂时，应充分了解对比试剂的技术信息，包括方法学、临床预期用途、主要性能指标、校准品的溯源情况、参考区间等，提供已上市产品的境内注册信息及说明书。应尽量选择方法学相同，线性范围、精密度、参考区间等性能接近的同类产品作为对比试剂。考核试剂的样本类型应不超过对比试剂。

5.3 试验方法

试验方法可参考有关方法学比对的技术指导文件（如：《体外诊断试剂分析性能评估（准确度-方法学比对）技术审查指导原则》）。考核试剂和对比试剂应平行操作，试验操作的过程中采用盲法。试验前应设定临床评价性能指标的可接受标准，如果比较研究试验结果无法达到预设标准，则考虑适当扩大样本量进行评价。扩大样本量和延长试验时间将提高试验的可靠性，建议本产品试验检测周期至少5d。

5.4 样本要求

子阳性等）的样本进行评价研究，充分考虑试验人群选择、疾病选择等内容，考虑到年龄、性别的差异，尽量覆盖各类适用人群。样本浓度应注重医学决定水平量值/参考区间临界值附近样本的选择，并涵盖检测范围，尽可能均匀分布。

5.5 样本量的确定

样本量应采用合理的统计学方法进行计算，应符合统计学要求。可选择总样本量不少于40例并分别采用考核试剂和对比试剂进行双份测定的方式，其中参考区间以外样本应不少于50%。亦可选择总样本量不少于100例并分别采用考核试剂和对比试剂进行单次测定的方式。

5.6 统计分析

首先进行离群值观察，离群值的个数不得超过限值（2.5%）。任一样本，如其两种方法测试的绝对差值/相对差值超所有样本两种方法测试绝对差值/相对差值的均值的4倍，则被判断为离群值[6]。

对临床试验结果的统计应结合临床试验数据的正/偏态分布情况选择合适的统计方法。建议给出每个样本考核试剂对比试剂之间的测定值、差值（偏差）及比值（偏差）散点图。观察数据分布的均匀性，对两组检测结果进行相关、线性回归及Bland-Altman分析，定量值结果应无统计学差异。回归分析一般包括：①以y=a+bx和R2的形式给出回归分析的拟合方程，其中：y是考核试剂结果，x是对比试剂结果，b是方程斜率，a是y轴截距，R2是判定系数，同时应给出b的95%（或99%）置信区间。②计算医学决定水平的预期偏倚及其95%置信区间。

5.7 不同样本

RBP测定试剂盒适用样本类型为血清和尿液时，两种样本不具有可比性，应分别进行符合统计学意义数量（参考“5.5样本量的确定”）的评估。考虑到对血清和尿液的检测结果可能存在一定差异，故建议对两种样本分别进行统计分析，以对考核试剂的临床性能进行综合分析。

6.小结

目前，已上市的RBP测定试剂盒主要通过免疫比浊法测定血清和/或尿液中RBP的含量。分析该产品的注册审评要点，有助于指导企业的注册申报工作，同时可为设计开发同类方法学的其他试剂盒带来启示。当试剂盒适用样本类型不具有可比性时，又无对应产品的指导原则或行业标准的情况下：①需要从技术要求、参考区间与临床评价等方面考虑样本基质对检测结果的影响；②性能指标中分析灵敏度及重复性用样本浓度选择建议参考医学决定水平及参考区间临界值，至少选择正常值和异常值水平两个浓度。特别需要说明的是，生产企业应关注相关法律法规、国家/行业标准等文件的时效性。