AR-A014418对γδT细胞增殖、凋亡及杀伤功能的影响①

郑 璐 孙蕾清 陈复兴 周 燏 吕小婷 陈 玲 李 莹 周忠海 陈永强

(解放军第97医院中心实验室，徐州221004)

Wnt/β-catenin信号通路是一条在进化中极为保守的通路，在调控干细胞的形成、细胞的分化、增殖和凋亡等生理过程中起重要作用[1,2]。由于在许多肿瘤中Wnt/β-catenin信号通路异常活化，许多研究发现该通路可以作为肿瘤治疗的靶点并研发出一系列Wnt信号通路抑制剂，目前已经进入临床试验[3,4]。近年来肿瘤患者自身免疫细胞及嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞免疫疗法成为研究的热点。Gattinoni等[5]利用Wnt信号通路激活剂TWS119活化T淋巴细胞的Wnt/β-catenin信号通路可以获得一群在体内具有较强的增殖和肿瘤杀伤活性的干细胞样记忆CD8+T细胞 (TSCM)，而且还发现CD19-CAR TSCM体内抗肿瘤效果优于传统的CD19-CAR T细胞[6]。我们前期研究发现TWS119还可以调节γδT细胞的分化、增殖及肿瘤杀伤活性[7,8]。AR-A014418(图1)也是一种选择性的GSK3β抑制剂，可以通过抑制GSK3β酶活性活化Wnt信号通路[9]。因此，本研究想观察Wnt信号通路激活剂AR-A014418对γδT细胞增殖、凋亡及其肿瘤杀伤活性的影响。

1 材料与方法

1.1材料 AR-A014418购自MCE公司，用二甲亚砜(DMSO)溶解配制成20 mmol/L的母液于-20℃储存；Annexin V-FITC/7-AAD apoptosis 试剂盒购自杭州联科生物技术股份有限公司；CFSE购自Invitrogen公司；帕米磷酸二钠购自深圳海王药业有限公司；RPMI1640和小牛血清购自Gibco 公司；人淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司；荧光抗体APC-pan γδTCR和FITC-γδ2TCR购自BD公司；Western及IP细胞裂解液试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶试剂盒、PVDF膜和BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒购自碧云天生物技术研究所；兔抗人Bcl-2、Bax、Caspase-3和β-Tublin一抗购自Abcam公司；人AB型血清购自徐州市血站。

1.2方法

1.2.1γδT细胞的培养及鉴定 抽取健康人外周抗凝血10 ml，用生理盐水1∶1稀释后加入淋巴细胞分离液，1 800 r/min离心15 min，分离获得人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMCs)。将分离获得的PBMCs加入γδT细胞完全培养基(含10%小牛血清、5%AB血清、3 μmol/L的帕米膦酸二钠和200 U/ml rhIL-2)中置于37℃、5%CO2培养箱中培养10 d。取培养10 d的γδT细胞用APC-pan γδTCR和FITC-γδ2TCR抗体标记细胞用流式细胞仪进行γδT细胞鉴定。

1.2.2细胞计数仪法检测AR-A014418对γδT细胞增殖的影响 取培养10 d的γδT细胞，调整细胞数1.0×106ml-1加入12孔板，加入终浓度分别为0.3、1、3、10 μmol/L的AR-A014418，每组设3个复孔，对照组加入等量的DMSO。培养72 h后取每组的细胞悬液用细胞计数仪进行细胞计数。

图1 AR-A014418结构式Fig.1 Structure of AR-A014418

1.2.3流式细胞仪检测AR-A014418对γδT细胞增殖的影响 取培养10 d的γδT细胞，用生理盐水将γδT细胞配成浓度为1.0×107ml-1的细胞悬液，加入终浓度为1 μmol/L的CFSE，37℃孵育15 min后加入10倍体积的完全培养基终止染色，离心洗涤2遍后，将CFSE标记的γδT细胞接种于12孔培养板，然后加入终浓度分别为0.3、1、3、10 μmol/L的AR-A014418，对照组加入等量的DMSO。于37℃、5%CO2培养箱中培养72 h。收集细胞并用PBS洗涤1次，每管加入anti-γδTCR-APC 5 μl，室温避光孵育15 min，PBS洗涤后，重悬于0.5 ml的PBS溶液中，用流式细胞术检测γδT细胞的增殖情况，试验重复3次。

1.2.4流式细胞仪检测AR-A014418对γδT细胞凋亡的影响 取培养10 d的γδT细胞，调整细胞数1.0×106ml-1加入12孔板，加入终浓度分别为0.3、1、3、10 μmol/L的AR-A014418，对照组加入等量的DMSO。培养72 h后收集细胞并用PBS洗涤1次，根据Annexin V-FITC/7-AAD 凋亡试剂盒说明书操作步骤，每管分别加入Annexin V-FITC和7-AAD，染色结束后用流式细胞术检测γδT细胞凋亡比例，试验重复3次。

1.2.5流式细胞仪检测γδT细胞体外杀伤活性 将AR-A014418处理72 h后的γδT细胞(效应细胞)与CFSE标记的人肝癌HepG2细胞和人胃癌SGC-7901细胞(靶细胞)按照效应细胞与靶细胞10∶1和20∶1的比例加入96孔U型孔中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养6 h。收集细胞并用PBS洗涤1次，每管加入7-AAD 5 μl,室温避光孵育5 min后，重悬于0.5 ml的PBS溶液中，用流式细胞术检测HepG2和SGC-7901细胞的凋亡情况，试验重复3次。

1.2.6Western blot分析蛋白的表达 γδT细胞经AR-A014418处理72 h后，收集细胞用Western及IP细胞裂解液50 μl充分裂解提取蛋白，BCA法测样品蛋白浓度后用12%SDS-PAGE分离，转膜，5%的脱脂奶粉封闭2 h，一抗(1∶1 000) 4℃封闭过夜，二抗(1∶1 000) 37℃孵育1 h。然后用成像系统检测并拍照，试验重复3次。

2 结果

2.1γδT细胞鉴定 分离获得人外周血单个核细胞，于37℃、5%CO2培养箱中用γδT细胞完全培养基培养10 d后流式细胞仪鉴定，结果如图2A、B显示，Pan γδT细胞纯度达到(87.6±4.3)%，Vδ2 T细胞比例约为(84.6±3.1)%。以上结果提示γδT 细胞培养成功，而且以Vδ2 T细胞为主可用于后续实验。

2.2AR-A014418对γδT细胞增殖的影响 CFSE 是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，CFSE 进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。在细胞分裂增殖过程中，CFSE 标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半。流式细胞术检测结果如图3A、 B显示AR-A014418浓度在0.3～3 μmol/L 范围内能显著促进γδT细胞的增殖，其中3 μmol/L 时增殖率最大 (P<0.05,P<0.01)，而当浓度大于3 μmol/L后γδT细胞增殖率又降低。细胞计数仪计数结果也同样显示AR-A014418在3 μmol/L时γδT细胞数由对照组的(3.18±0.12)×106个升高到(4.21±0.26)×106个(P<0.05,P<0.01)(图3C)。另外，如图3D所示AR-A014418对γδT细胞亚群的改变没有明显变化。

图2 γδT细胞鉴定Fig.2 Identification of γδT cells

2.3AR-A014418对γδT细胞凋亡的影响 培养10 d后的γδT细胞再经AR-A014418处理72 h后，经Annexin V-FITC /7-AAD双染后，流式细胞术检测结果如图4A、B所示，对照组γδT细胞凋亡率为(25.14±1.94)%，而经0.3、1、3和10 μmol/L的AR-A014418处理后，细胞凋亡率分别为：(21.08±1.37)%、(18.38±2.83)%、(16.01±2.33)%和(22.57±1.89)%。以上结果表明AR-A014418体外可以抑制γδT细胞的凋亡(P<0.05,P<0.01)。同时，经0.3、1、3和10 μmol/L的AR-A014418处理72 h后，蛋白水平检测显示，促凋亡蛋白Cleaved caspase-3和Bax表达量逐渐减弱，而抗凋亡蛋白Bcl-2表达量逐渐增强(图4C)。

2.4AR-A014418对γδT细胞杀伤人肿瘤细胞活性的影响 根据以上实验结果显示，3 μmol/L的AR-A014418促进γδT细胞增殖且抑制其凋亡结果最显著。因此我们选择3 μmol/L的AR-A014418处理72 h 后的γδT细胞作为效应细胞，以人肝癌HepG2细胞和人胃癌SGC-7901细胞作为靶细胞，按照效靶比分别为10∶1和20∶1进行体外杀伤实验检测。流式细胞术检测结果如图5A、B所示，与对照组相比，3 μmol/L AR-A014418处理后的γδT细胞对人肝癌HepG2细胞杀伤效率 (18.01±2.04)% vs (33.8±3.41)%和(36.03±2.76)% vs (57.82±4.15)%显著提高(P<0.01)；对人胃癌SGC-7901细胞杀伤效率 (27.30±1.70)% vs (42.43±3.93)% 和(46.82±4.61)% vs (71.67±5.27)%显著提高(P<0.05,P<0.01)。以上结果显示AR-A014418可以增强γδT细胞的体外杀伤肿瘤活性。

图3 AR-A014418对γδT细胞增殖的影响Fig.3 Effect of AR-A014418 on growth of γδT cellsNote: *.P<0.05；**.P<0.01.

图4 AR-A014418对γδT细胞凋亡的影响Fig.4 Effect of AR-A014418 on apoptosis of γδT cellsNote: *.P<0.05；**.P<0.01.

图5 AR-A014418处理后的γδT细胞对人肝癌HepG2细胞和人胃癌SGC-7901细胞的杀伤效应Fig.5 Killing activities of γδT cells treated with AR-A014418 against HepG2 and SGC-7901 cells

3 讨论

γδT细胞是T淋巴细胞中表达γδTCR的一个亚群，是近年来研究较多的抗肿瘤免疫效应细胞之一，主要以MHC非限制性方式识别肿瘤抗原从而发挥杀伤作用[10]。目前体外常规扩增的γδT细胞已经用于多种肿瘤的治疗，并取得较好的疗效[11,12]。为了提高γδT细胞治疗肿瘤效果，目前国内外研究主要集中于通过多种细胞因子和药物等进行诱导培养γδT细胞及条件优化，来提高γδT细胞的体外增殖倍数及杀伤功能[8,13-16]。本实验结果显示，AR-A014418在0.3～3 μmol/L浓度范围时不仅能促进体外γδT细胞的增殖，而且还能抑制其凋亡，尤其在3 μmol/L效果最为显著。另外在3 μmol/L时AR-A014418还能增强γδT细胞的体外杀伤人肝癌HepG2细胞和人胃癌SGC-7901细胞活性。提示AR-A014418可以提高体外培养γδT细胞的数量和功能，为今后体外扩增γδT细胞用于肿瘤患者细胞免疫治疗提供了实验依据。

糖原合酶激酶-3β (Glycogen synthase kinase -3β，GSK-3β)是Wnt/β-catenin信号通路的负向调节激酶，是药物筛选的重要靶点。目前针对该靶点的靶向药物Lithium和Valproic acid已获批分别用于治疗抑郁症和癫痫病；Flavopiridol 和Staurosporine 用于晚期实体瘤和血液病的治疗已经进入临床Ⅱ期[17]。我们前期实验发现GSK-3β抑制剂TWS119在体外可以增强γδT细胞的增殖和肿瘤杀伤活性[7,8]。本研究发现GSK-3β另一抑制剂AR-A014418也具有类似功能，提示我们GSK-3β可能成为今后体外扩增γδT细胞的有效靶点。

综上所述，GSK-3β抑制剂AR-A014418在3 μmol/L 浓度时，可以抑制体外扩增γδT细胞的凋亡，并且还能增强其体外增殖和杀伤肿瘤活性。结合前期研究和上述结论说明GSK-3β可能成为今后体外扩增γδT细胞的有效靶点，以及GSK-3β抑制剂AR-A014418具有一定的免疫调节功能，为今后的临床应用提供实验依据。