天津地区警犬点滴复膜酵母菌的流行病学调查及致病性研究

韩雨希，姜轩，葛秀国，安晓康，朱子达，赵瑞利，通信作者，马吉飞，李玥，王聪，徐良麟



天津地区警犬点滴复膜酵母菌的流行病学调查及致病性研究

韩雨希1，姜轩1，葛秀国1，安晓康1，朱子达1，赵瑞利1，通信作者，马吉飞1，李玥2，王聪1，徐良麟1

（1. 天津农学院 动物科学与动物医学学院，天津 300384；2. 天津农学院 附属动物医院，天津 300384）

为研究点滴复膜酵母菌（）分子流行病学及对犬肠道的致病性，试验从天津地区3个大型警犬基地分批次采集约222份粪便样本，对粪便样本中疑似点滴复膜酵母菌进行镜检、分离培养、染色鉴定、酵母菌基因组提取及18S rRNA基因鉴定，并对分离的菌株进行犬致病性研究。结果显示，警犬基地一警犬点滴复膜酵母菌阳性样本35个，阳性携带率约 15.77%；通过染色确定该酵母菌的增殖方式为出芽生殖性；通过18S rRNA基因扩增出目的条带约400 bp；实验犬6只，进行犬点滴复膜酵母菌的致病性研究，结果2只犬出现腹泻血便症状，粪便镜检发现点滴复膜酵母或疑似酵母菌孢子，点滴复膜酵母菌对犬可能作为一种机会致病菌，在一定条件下可引起犬的肠道感染。

警犬；点滴腹膜酵母菌；流行病学；致病性

点滴复膜酵母菌（）属于真菌，是构成啮齿类动物如兔子等肠道的正常菌群，目前国内外针对点滴复膜酵母菌对宠物犬或警犬致病性方面的报道很少，其致病性在不同种属间存在争议[1]。 有研究报道，在慢性腹泻犬的粪便中检出大量脱落的点滴复膜酵母菌，由于具体腹泻原因并未发现，但在正常犬体内也能找到点滴复膜酵母菌，虽然没有直接证据证明点滴复膜酵母菌导致犬腹泻、便血，但其很有可能成为机会性致病菌[2]。

与犬相关的大多数酵母菌种与正常犬类动物共生，其中包括假丝酵母菌属（）、酿酒酵母（）和红酵母属（spp.）[3]。尽管如此，这些属的酵母菌也被报道为人和犬等各种动物的局部和系统感染的病原体，最常见的原因是宿主物理化学或免疫防御障碍的干扰而导致微生物大量繁殖[4]。Winston等[5]报道，犬在确诊感染点滴复膜酵母菌后，出现慢性腹泻的症状。而自荷兰研究人员报道，酵母菌大量存在于当地腹泻的猫和狗中[6-7]。现从天津地区某警犬基地共采集约222份粪便样本，对粪便样本进行显微镜检测，对其进行点滴复膜酵母菌的检出率统计，并进行犬的致病性研究，为点滴复膜酵母菌与犬腹泻在临床上关联提供理论依据。

1 材料

1.1 样本来源

分别从天津地区3个警犬基地共采集约222份粪便样本。

1.2 试验动物

试验犬（田园犬）共6只，年龄约1岁，体重约7 kg，雄性2只，雌性4只。

1.3 主要试剂

沙堡罗葡萄糖琼脂培养基（环凯微生物科技有限公司）；孔雀石绿染液、复红染液（南京建成科技有限公司）；酵母基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）；DNA-Marker（DL 2000）、5×Loading Buffer、2×Master Mix（上海捷瑞生物工程有限公司）；琼脂糖、1×TAE（上海捷瑞生物工程有限公司）；核酸染色剂（北京索莱宝生物科技有限公司）。18P1：GCATCGATGAAGA ACGCAGC；18P2：TCCTCCGCTTATTGATATGC（引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成）。

1.4 主要仪器设备

恒温培养箱（上海福玛实验设备有限公司）、生物显微镜（重庆奥特光学仪器有限公司）、自动内校电子分析天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）、超净工作台（江苏苏净集团有限公司）、 PCR 仪、S1000 凝胶成像系统（伯乐生命医学产品有限公司）、稳压温流电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司）。

2 实验方法

2.1 粪便样本采集及镜检

从天津3个大型警犬基地采集粪便样本222份，保存于粪便采集袋中，实验室进行显微镜镜检。

2.2 沙堡罗葡萄糖琼脂培养基培养

对初步镜检点滴腹膜酵母菌阳性的粪便样本用沙堡罗葡萄糖琼脂培养基进行培养，置于37 ℃恒温培养箱培养2～3 d，观察菌落特征。

2.3 水浸片镜检

用接种环在培养基中挑取少量带有孢子的菌丝，用50%乙醇浸润，用蒸馏水将菌丝浸泡，将菌丝分散开，盖上盖玻片，低倍镜观察。

2.4 染色剂染色镜检

用接种环挑取菌丝于洁净的载玻片上，与载玻片上的一滴蒸馏水充分混合，晾干后火焰烤干固定，加孔雀石绿染液染片5 min，再用复红染液复染1 min，干燥后镜检观察形态。

2.5 酵母菌基因组DNA提取及18S rRNA基因检测

利用酵母菌基因组提取试剂盒提取点滴复膜酵母菌的DNA，提取过程中注意酵母菌细胞壁的破碎，DNA产物保存于-20 ℃。设计引物进行PCR扩增，扩增体系为：DNA 模板 5 μL，10×buffer 2.5 μL，MgCl21 μL，dNTP（2.5 mmol/L）1 μL，上、下游引物各 2 μL，0.5 μL，用 ddH2O 补体系至 25 μL。PCR 扩增程序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30个循环；72 ℃ 10 min。以1%琼脂糖核酸凝胶电泳检测 PCR 产物[8]。

2.6 点滴腹膜酵母菌犬的致病性试验

用沙堡罗葡萄糖液体培养基摇取菌液，并用细胞计数板按下式计数细胞悬液的密度：细胞密度＝（4个大格细胞总数/4）×104个/mL。浓度达到109时，在每只犬饲料中混合10 mL菌液饲喂4只，另外2只作为空白对照饲喂等量的生理盐水[9]。试验开始后每天采集粪便，稀释后镜下观察点滴复膜酵母菌是否存在，以及粗略估计存在量，并且持续观察犬粪便状况并检查粪便中点滴复膜酵母菌孢子的数量。同时观察实验过程中犬有无异常现象，如精神不振、食欲下降等，观察粪便有无稀便、水样便、血样便等情况。

3 结果与分析

3.1 样本采集及镜检

对天津市3个大型警犬基地的粪便采集及初步镜检，结果见表1、图1。

表1 粪便样本采集及点滴复膜酵母菌带菌情况

由表1可看出，天津市警犬基地一点滴复膜酵母菌检出率较高，达到15.77%，大多数警犬都伴有腹泻，其他两个警犬基地未检出点滴复膜酵母菌。

图1 粪便样本镜检结果（40×）

注：A、B均为点滴复膜酵母阳性粪便涂片观察结果

3.2 沙堡罗葡萄糖琼脂培养基培养

对粪便初步镜检点滴复膜酵母阳性的粪便样本划线培养于沙堡罗葡萄糖琼脂培养基，培养结果如图2。

图2 沙堡罗葡萄糖培养基培养结果

注：A为培养2 d结果；B为培养3 d结果；C为培养4 d结果

3.3 水浸片镜检

从沙堡罗葡萄糖琼脂培养基上挑取真菌菌丝进行水浸片镜检，结果如图3。

图3 水浸片镜检结果（40×）

注：A、B分别为点滴复膜酵母菌丝水浸片镜检结果

3.4 染色剂染色镜检

用孔雀石绿染液-复红染液对点滴复膜酵母菌进行染色，在显微镜下可观察到长柱状细胞连接成的菌丝、突出的呈球状的紫红色孢子囊以及孢囊孢子，说明该酵母菌为出芽生殖性酵母菌，染色结果如图4。

图4 孔雀石绿-复红染色结果（40×）

注：A、B均为点滴复膜酵母菌染色结果

3.5 酵母基因组DNA提取及18S rRNA基因检测

用提取出的酵母菌DNA产物进行18S rRNA基因检测，得到大约400 bp条带，与预期目的条带大小相符。电泳结果如图5。

图5 18S rRNA基因电泳结果

注：M为DL-2000 Marker；1为阴性对照；2为18S rRNA基因目的条带（400 bp）

3.6 犬致病性试验

通过连续给4只试验犬饲喂点滴复膜酵母菌，一周后1只试验犬精神萎靡、饮食下降、被毛蓬乱，并开始便血；间隔2 d后另1只试验犬腹泻伴红褐色血液。每天对2只便血犬粪便分别进行镜检，发现大量红细胞及点滴复膜酵母菌、淀粉颗粒及疑似脂肪滴。镜检发现点滴复膜酵母菌及疑似酵母菌的孢子（图6）。其他2只试验犬，除有轻微精神不振外，无其他明显症状，对其粪便镜检观察无点滴复膜酵母菌存在。

图6 粪便镜检图片（40×）

注：A、B、C、D均为点滴复膜酵母菌阳性粪便涂片镜检结果

4 讨论

通过对天津市3个大型警犬基地分批次采集的约222份粪便样本中点滴复膜酵母菌进行镜检、分离培养、染色鉴定、酵母菌基因组提取及18S rRNA基因鉴定，并对分离的菌株进行犬致病性研究调查，结果只在天津市警犬基地一发现点滴复膜酵母菌阳性检出率较高，约15.77%，并伴有不同程度的慢性腹泻，原因可能是天津市警犬基地一的病犬年龄均为6岁以上，属于老龄犬，而另两个警犬基地的警犬都为青壮犬；在警犬基地一对病犬的亲系进行调查，并未检出点滴复膜酵母菌，说明该酵母菌可能为机会性致病菌。

犬腹泻性疾病的常见致病菌为大肠杆菌、沙门氏菌、耶尔森菌、变形杆菌等[9]，点滴复膜酵母菌是否会致犬腹泻并无确切论证，但其作为兔肠道正常菌且无致病性已被石团员等人验证[10]。本试验进行点滴复膜酵母菌犬的致病性试验，结果有两例犬出现腹泻及便血症状，对其镜检发现点滴复膜酵母菌及疑似酵母菌孢子，其他试验犬未出现腹泻症状及镜检未见点滴复膜酵母菌。进一步研究应增加试验犬的数量，对点滴复膜酵母菌的致病性进行研究。

通过对本次检出的点滴复膜酵母菌进行染色镜检，确定该酵母菌为出芽生殖性酵母菌。目前，临床对于镜检点滴复膜酵母菌的腹泻及便血犬，应及时给予伊曲康唑等治疗。本研究的警犬基地一给予抗真菌药物的治疗后，病犬的慢性腹泻及便血症状消失。该菌虽被认为是机会致病菌，但不能忽视其致病性，由该酵母菌引起的腹泻通常伴有便血的特点，容易与其他病混淆，造成误诊，耽误病情。通过本次对天津市警犬粪便样本检测，发现点滴复膜酵母菌大量存在于犬的肠道，并有机会成为致病菌，本试验为点滴复膜酵母菌的致病性研究提供了参考依据。

[1] Hersey-Benner C. Diarrhea in a rabbit.yeast[J]. Lab Animal，2008，37 （8）： 347-349.

[2] 陈光，刘振堂. 疑似点滴复膜酵母致警犬便血的病例报告1例[J]. 中国工作犬业，2017（4）：21-22.

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[10] 石团员，魏巍，付媛，等. 穿孔艾美耳球虫、点滴复膜酵母与兔腹泻的关系[J]. 浙江农业学报，2015，27（2）：160-164.

责任编辑：张爱婷

The epidemiological investigation and pathogenicity study onof police dogs inTianjin area

HAN Yu-xi1, JIANG Xuan1,GE Xiu-guo1, AN Xiao-kang1, ZHU Zi-da1, ZHAO Rui-li1,Corresponding Author, MA Ji-fei1, LI Yue2,WANG Cong1, XU Liang-lin1

（1. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2. Animal Hospital Affiliated to Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

To study the molecular epidemiology ofand its pathogenicity to dog intestine, 222 fecal samples were collected from three large police dogs bases in Tianjin area. Microscope examination, separated culture, dyeing identification, yeast genome extraction and 18S rRNA gene identification ofin the fecal samples were carried out, and the isolated strains were studied for the pathogenicity of the dogs. Results showed that there were 35positive samples from the police dog base in Xiqing, and the positive rate was about 15.77%. The proliferation mode of the yeast was identified as germ producing yeast by dyeing. The target band was amplified by 18S rRNA gene to get about 400 bp, and 6 experimental dogs were studied for the pathogenicity. The symptoms of diarrhea and stool were found in two dogs. By fecal microscopic examination droppings of yeast or yeast spore were found. Therefore, themay be as an opportunistic pathogenic bacteria, which can cause intestinal infection under certain conditions in dogs.

police dog;; epidemiology; pathogenicity

1008-5394（2018）04-0044-04

10.19640/j.cnki.jtau.2018.04.010

S852.611

A

2018-06-03

天津市大学生创新训练项目（201610061004）；天津市高校“中青年骨干创新人才培养计划”项目（无编号）；天津市“131”创新型人才资助项目（无编号）；天津农学院附属动物医院关键技术集成与学生综合能力提升（ZH004901）；天津市生猪产业技术体系创新团队-猪细菌病岗位项目（ITTPRS2017004）

韩雨希（1996-），女，本科在读，研究方向：小动物医学。E-mail：1027397853@qq.com。

赵瑞利（1979-），女，副教授，博士，研究方向：分子病原细菌学。E-mail：zhaoruili1109@126.com。