线纹海马Hippocampus erectus的tlr21基因结构及其对CpG-ODN的应答特征

张媛, 秦耿, 张博, 林强



线纹海马的基因结构及其对CpG-ODN的应答特征

张媛1, 2, 秦耿1, 张博1, 2, 林强1, 2

1. 中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室, 中国科学院南海海洋研究所, 广东 广州 510301; 2. 中国科学院大学, 北京 100049

作为先天性免疫反应中重要的模式识别受体之一,(toll-like receptor)基因家族介导的先天性免疫是脊椎动物抵御病原微生物的重要防线。研究分析了线纹海马基因的序列特征, 并基于抗原注射实验探讨了海马的免疫功能。线纹海马基因的开放阅读框长度为2946bp, 编码981个氨基酸, 预测其编码蛋白相对分子量为246.98kDa, 理论等电点为4.78。编码蛋白主要包含1个信号肽和3个功能结构域: 胞外区具有14个富含亮氨酸重复序列的结构域(LRR), 跨膜区具有富含半胱氨酸的结构域, 胞内区则具有TIR结构域。同源性比较和系统进化分析表明, 线纹海马基因与虎尾海马基因的同源性最高, 其次与斜带石斑鱼、牙鲆、大菱鲆和红鳍东方鲀的基因聚为一枝。基因在线纹海马的脑、鳃、肝、肠、肾、性腺、肌肉和育儿袋各组织均有分布, 肾脏中表达量最高。抗原注射实验结果发现, 线纹海马Tlr21对不同类型CpG寡脱氧核苷酸(CpG-ODNs)的识别能力存在差异, 其中, CpG-2007和CpG-HC4040对海马肾脏的mRNA表达量具有显著的促进作用(＜0.05)。研究表明线纹海马Tlr21能够通过识别含CpG序列的DNA发挥免疫识别作用, 研究结果将有助于系统认识海马免疫系统中家族基因的功能特征, 为建立海马病害防治策略提供理论依据。

; 基因结构; CpG-ODN; 免疫; 线纹海马; 组织表达差异

Toll样受体(TLR, toll-like receptor)是先天性免疫反应中重要的模式识别受体之一。TLR介导的先天性免疫是脊椎动物抵御病原微生物的第一道防线, 其在连接先天性免疫和获得性免疫反应过程中起着非常重要的桥梁作用(Janeway et al, 2012)。基因编码的蛋白富含亮氨酸重复序列的功能域(leucine-rich repeats, LRR)能够特异性地识别不同类型的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMP), 例如, 蛋白、糖类、脂质、核酸及这些生物大分子的衍生物(O’Neill et al, 2013)。TLR通过胞内区TIR(toll/interleukin-l receptor domain, TIR)结构域和含有TIR结构域的衔接分子, 如髓样分化因子88(myeloid differentiation primary response gene, Myd88)激活下游信号通路, 启动细胞因子表达等宿主的免疫应答反应(Palti, 2011)。

基因家族在哺乳动物中非常保守, 人类有10个基因家族成员, 鼠有13个(Kawai et al, 2010; Moresco et al, 2011)。鱼类基因种类比哺乳动物具有更高的多样性。大多数硬骨鱼具有22种相对保守的基因(Takano et al, 2010; Quiniou et al, 2013), 其中包含和等鱼类和哺乳动物共有基因家族成员(Hwang et al, 2011; Wang et al, 2015)。同时, 鱼类基因表现出独特的进化特征, 例如, 除了斑马鱼等少数鱼类, 绝大多数鱼类缺失基因(Meijer et al, 2004); 大西洋鳕鱼的基因家族则发生显著变异,、、和基因丢失, 而、、、和基因发生显著扩张(Sundaram et al, 2012)。

细菌DNA是病原细菌的主要成分之一, 其中CpG-DNA是广泛存在于细菌、病毒和无脊椎动物DNA中具有免疫活性的较短的核苷酸序列(Krieg et al, 1995; Sato et al, 1996)。目前已确定TLR9与TLR21能够特异性识别CpG DNA, 哺乳动物只有TLR9, 能够特异性识别细菌CpG-DNA(Oshiumi et al, 2003); 鸟类缺失TLR9, 由TLR21替代TLR9特异性识别CpG-DNA(Hemmi et al, 2000; Keestra et al, 2010); 斑马鱼中同时存在Tlr9和Tlr21, 两者都能够特异性识别CpG-DNA, 但Tlr9能够识别更多类型的CpG DNA, 而Tlr21对特定结构的GpG DNA识别能力更强(Yeh et al, 2013)。

Tlr21最早发现于红鳍东方鲀中, 之后在两栖类(Ishii et al, 2007)、鸟类(Temperly et al, 2008)和其他鱼类(Sundaram et al, 2012; Wang et al, 2013; Li et al, 2017)中都发现存在Tlr21。TLR21在生物体的各器官组织中广泛表达, 能够识别革兰氏阴性菌(Reyes-Becerril et al, 2016)、病毒(Yeh et al, 2017)以及原虫(Li et al, 2012), 并在识别特定的病原相关分子模式后产生免疫反应。Tlr21在鱼类中的功能已有一些报道。Tlr21在大菱鲆不同器官广泛表达, 且在淋巴组织丰富的脾脏和头肾中表达量较高, 用聚肌胞苷酸(polyI:C)、大菱鲆红体病病毒TRBIV和CpG-ODN 2395(5′- TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG -3′)进行体内感染后, 鳃、头肾、体肾和肌肉中的mRNA表达量显著上调(Li et al, 2017)。斑马鱼的在各组织中均有表达, 肠、脾脏和肾中表达量最高, 斑马鱼Tlr21能够广泛识别含有特定基序的CpG-ODN, 对含GTCGTT基序CpG-ODN的反应尤为明显, 表现为在脾脏中表达量上调, 进而引起γ干扰素(interferon-γ, IFN-γ)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor beta, TNFb)和白细胞介素1(interleukin-1 , IL-1)的产生(Yeh et al, 2013)。除了肾和脾脏等常见的免疫器官, Tlr21还在鱼类骨骼肌中发挥作用, 奥氏弧菌侵染比目鱼, 导致骨骼肌中表达量显著升高, 刺激白介素IL-1b产生, 激活NFκB通路, 并产生TNFα(Valenzuela et al, 2017)。

海马具有独特的形态特征和繁殖行为策略, 是目前进化速率最快的一种硬骨鱼类(Lin et al, 2016)。相关研究发现包括海马在内的海龙科鱼类的免疫相关基因与其他鱼类明显不同。形态学研究也发现海马的免疫系统存在独特的进化特征, 比如, 海马没有脾脏, 没有典型的头肾, 体表裸露, 没有鳞片和大量黏液包被, 同时肠系膜中缺乏肠淋巴组织(gut-associated lymphatic tissue, GALT)(Matsunagaet al, 1998)。线纹海马已经成为我国海马养殖的主要品种, 因此, 对于更全面认识海马的免疫系统功能及病害防治研究也尤显重要。本研究对线纹海马的进行了克隆与鉴定, 进行了序列特征分析和系统进化分析, 并通过开展CpG-DNA腹腔注射实验, 检测海马基因的表达模式, 对海马基因的功能进行了探讨。本文的研究结果可以为海马基因家族及其免疫应答作用研究提供基础数据, 也对今后的海马病害防控、疫苗佐剂筛选等有指导意义。

1 材料和方法

1.1 实验材料

健康线纹海马取自中国科学院南海海洋研究所深圳海马养殖基地, 平均体长9.16cm, 平均体重2.75g, 取回后在中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室海水养殖平台暂养两周, 期间溶氧充足, 水温26±1℃, 盐度为(28±2)‰, 每天投喂两次冷冻糠虾饲料(09:00和16:00), 光照周期12h︰12h。

1.2 cDNA合成与tlr21基因克隆

解剖5只健康海马, 分别取脑、鳃、性腺、肝、肠、肾、肌肉、育儿袋等8种组织, 采用预冷的2×PBS洗涤3次, 液氮保存。采用TRIzol抽提法(Thermo公司)获得总RNA。以总RNA为模板, 利用PrimeScript® RT reagent Kit With gDNA Eraser反转录试剂盒(Toyobo公司)合成cDNA。参照线纹海马全基因组的参考序列, 使用引物设计软件Primer premier 5.0分段设计引物(表1), 进行PCR克隆, PCR程序为: 94℃、5min预变性; 94℃、40s, 53℃、30s, 72℃、45s, 共34个循环; 72℃延伸10min, 4℃保存。对获得的PCR产物进行连接转, 筛选之后送Introvigen公司测序, 将获得的序列使用DNAman8进行序列比对, 按片段顺序进行拼接, 获得全长序列。

1.3 基因特征分析

使用DNAman软件对线纹海马全长序列进行分析; 使用Bio-edit进行序列多重比对; 用NCBI在线软件BLAST进行同源性比对; 使用NCBI在线软件ORF finder 预测开放阅读框架; 使用ProtParam Tool预测等电点和蛋白质分子量; 使用SMART软件推测目的基因的结构域。分析线纹海马Tlr21与其他物种Tlr21的氨基酸序列, 通过MEGA6.0软件NJ(neighbor-joining)方法, 构建系统进化树。

表1 引物信息

1.4 CpG-ODN注射实验

CpG-DNA是存在于细菌、病毒和无脊椎动物的DNA中的具有免疫活性的较短的核苷酸序列。人工合成的含CpG基序的寡聚核苷酸(oligonucleotide, ODN)被称为CpG-ODN。CpG-ODN注射实验共使用30只海马, 将实验用海马随机分成5组, 每组包含6只海马, 实验前一天停止投喂。实验组分别选用CpG-2000、CpG-2006、CpG-2007和CpG-HC4040进行海马腹腔注射, 采用无菌PBS缓冲液溶解, 注射体系为30μL, 药物剂量为1μg, 对照组注射等剂量无菌PBS缓冲液。注射48h后取样, 解剖提取海马的肾脏组织, 液氮保存。采用TRIzol法提取RNA, 反转录获得cDNA。

实验所用硫代化CpG-ODN由Introvigen公司合成, 序列信息见表2。

表2 实验中所用硫代化修饰CpG-ODNs的序列

注: 易被Tlr21识别的基序用加粗字体表示。

1.5 实时荧光定量PCR检测

根据克隆获得的线纹海马序列设计定量引物, 内参基因使用肌动蛋白()基因(表1)。引物均由上海生工生物科技有限公司合成。按照SYBR® Premix Ex Taq™ (TliRNaseH Plus)试剂盒(TaKaRa公司)说明书, 用qPCRLightCycler480 (Roche, USA)进行荧光定量PCR。PCR程序为: 95℃、20s预变性; 95℃、5s, 60℃、30s, 共35个循环; 反应后55℃上升至95℃测定熔解曲线检测反应特异性。

1.6 数据分析

基因表达结果采用相对表达量的形式, 以2-ΔΔCt法进行计算(Livak et al, 2001)。使用 Microsoft Excel 2010和SPSS13.0对数据进行统计分析, 所有数据最终以M±SD(平均值±标准差)呈现, 显著性差异用值表示,＞0.05表示差异不显著,＜0.05表示差异显著,＜0.01表示差异达到极显著水平。作图采用SigmaPlot 12.5( Systat Software Inc.)软件。

2 结果

2.1 线纹海马tlr21基因序列及蛋白质结构特征

线纹海马的开放阅读框长度为2946bp, 该阅读框架编码的蛋白含981个氨基酸, 预测其相对分子量为246.98kDa, 理论等电点为4.78。大部分生物TLR21具有两个常见的对CpG-DNA起重要识别作用的氨基酸残基: Asp534(D)和Tyr536(Y), 在线纹海马Tlr21中只具有其中一个保守的位点Asp444(D)(图1a)。氨基酸序列结构特征分析显示,编码的蛋白主要由3个功能区构成: 胞外区、跨膜区和胞内区。胞外区具有14个富含亮氨酸重复序列的结构域(leucine-rich repeats, LRR), 跨膜区(TM)具有富含半胱氨酸的结构域, 胞内区则具有TIR结构域(图1b)。

图1 线纹海马tlr21基因全长核苷酸序列以及编码的氨基酸序列与(a)线纹海马Tlr21蛋白结构预测(b)

起始密码子和终止密码子用细线方框标出, 用*表示终止密码子, 与CpG-DNA结合有关的保守氨基酸用红色方框标记, TIR中的保守box用虚线方框标记。LRR: 灰色阴影表示, TIR: 绿色, 跨膜区域: 蓝色, 信号肽: 红色

Fig. 1 Nucleotide and amino acid sequences ofin lined seahorse(a) and structure features of Tlr21in(b). Initiation codon and termination codon are marked with thin line boxes. Termination codon is represented by an asterisk. Conserved amino acids related to CpG-DNA recognition are marked with red line box. Three conserved boxes are marked with dotted box. Grey shading represents LRR domain, green shading represents TIR, blue shading represents transmembrane region (TM), and red shading represents signal peptide

2.2 线纹海马tlr21基因系统进化特征

同源性比较和系统进化分析显示(图2), 线纹海马在进化过程中比较保守, 与其他硬骨鱼类的相似度较高。线纹海马的与虎尾海马的聚为一枝, 两者相似度超过98%。同时, 线纹海马与斜带石斑鱼、大菱鲆牙鲆的序列同源性都较高, 相似度分别为63%、61%和61%。

图2 基于NJ法构建的线纹海马tlr21系统进化树

2.3 线纹海马tlr21基因在不同组织中的表达特征

如图3所示, 荧光定量PCR结果表明,在线纹海马的脑、鳃、肝、肾、肠、性腺、肌肉、育儿袋8种组织中均有表达, 在肾脏中表达量最高, 在其他组织中分布水平较低。肾脏表达量为脑的3.2倍, 其次在鳃中高表达, 表达量约为脑的2倍, 肾脏中表达量与其他各组织中表达量的差异水平为极显著(＜0.001)

图3 tlr21在线纹海马不同组织中的表达特征

样本容量=5; 星号**表示统计学差异极显著(＜0.01)

Fig. 3 Expression ofin different tissues ofSample size=5. The asterisks ** indicate extremely significant difference (＜0.01)

2.4 tlr21在注射CpG-ODN后的差异表达分析

图4所示CpG-ODN线纹海马腹腔注射实验结果表明, 含有GTCGTT特征基序的CpG-2007和含有AACGTT的CpG-HC4040注射组的的表达量与对照组相比出现明显上调, 而含有GACGTT特征基序的CpG-2000和含有GTCGTT特征基序的CpG-2006注射组的表达量降低。经单因素方差分析得出, 与PBS对照组相比, CpG-HC4040注射组1表达量上调达到显著水平(=0.022,＜0.05), 其他各组与PBS对照组相比, 表达量差异不显著(＞0.05)。CpG-2000注射组的表达量不足PBS对照组的1/2(0.46倍), CpG-2006注射组的1表达量仅为PBS对照组的1/5。CpG-HC4040组的表达量水平, 显著高于CpG-2000和CpG-2006注射组,值分别为0.017和0.016(＜0.05)。其他各注射组间的表达量差异均未达到显著水平(＞0.05)。

图4 CpG-ODN注射后tlr21在线纹海马肾脏中的表达模式

样本容量=6; 星号*表示统计学差异显著(＜0.05)

Fig. 4 Results forexpression ofin kidney tissues after CpG-ODN injection. Sample size=6. The asterisk * indicates significant statistical difference (＜0.05)

3 讨论

3.1 线纹海马tlr21基因序列及蛋白质结构特征

本研究首次从线纹海马中克隆得到了基因, 并对其基因序列、编码的蛋白质结构、表达模式和特异性识别序列刺激下的表达模式进行了初步研究。基因家族在进化过程中十分保守, 本研究克隆得到的线纹海马基因的开放阅读框为2946bp, 编码蛋白含981个氨基酸, 蛋白序列长度与其他鱼类的类似, 比如, 日本鳗鲡编码978个氨基酸, 黄颡鱼编码982个氨基酸, 石斑鱼编码979个氨基酸, 而大菱鲆编码984个氨基酸。然而, 已报道的日本鳗鲡等鱼类的编码蛋白分子量通常不高于120kDa, 但本研究发现海马编码蛋白的预测分子量为246.98kDa,远高于其他鱼类(李春艳等, 2017; 王凯伦, 2017; Li et al, 2017)。

基因家族编码的蛋白主要由3个典型功能区构成: 胞外区、跨膜区和胞内区。胞外区通常含有2~25个富含亮氨酸重复序列的LRR结构域, 能特异性识别病原微生物保守的PAMP, 向细胞内传递信号。胞外区在进化过程中具有较大的变异性, 从而适应不同的配体分子(O’Neill et al, 2013)。LRR通常含有20~43个氨基酸残基, 基序分为保守区和可变区, 保守区通常为LxxLxLxxNxL或LxxLxLxxCxxL, L为亮氨酸Leu, N为天门冬酰胺Asn, C为半胱氨酸Cys, x为可变氨基酸(Kang et al, 2011)。胞内区是TIR结构域, 是Tlrs与接头蛋白都具有的高度同源结构域, 功能是募集接头蛋白, 激活下游信号通路, 从而触发细胞内的免疫反应, 其序列与白细胞介素1受体1L-1R家族的胞质区序列有高度同源性(Takeda et al, 2003)。基因家族的蛋白质的TIR结构域中存在3个保守的Box, 它们在所有鱼类细胞质Tlr9和Tlr21中都是保守的(O’Neill et al, 2003), Box1和Box2主要参与信号转导, Box3则主要参与受体在细胞内的定位(Slack et al, 2000)。Box2 中的P为保守的脯氨酸, 在鸡、鼠、红鳍东方鲀、蟾胡鲶、斑点叉尾鮰以及日本鳗鲡等鱼类的Tlr21中都是保守的(Gao et al, 2013; Reyes-Becerril et al, 2016; 李春艳等, 2017)。由本研究的结果可知, 线纹海马的Tlr21蛋白具有这3种典型的功能区域, 具有1个信号肽、14个LRR结构域、1个跨膜区和1个TIR结构域, 与其他鱼类的Tlr21结构类似, 并且保留了LRR和TIR中的特征基序和保守氨基酸位点, 线纹海马的Tlr21 在Box2区域与其他物种同样保守, 表明其病原体识别功能及信号转导机制可能与其他鱼类的Tlr21相似(O’Neill et al, 2013)。同时, 人类TLR9有2个保守的氨基酸Asp535(D)和Tyr536(Y), 参与与CpG-DNA的相互作用(Brownlie, 2009 Keestra et al, 2010), 这两个氨基酸在斑马鱼Tlr9和Tlr21等一些鱼类、非洲爪蟾的TLR21和鸡的TLR21中都是保守的(Li et al, 2017)。但本研究发现线纹海马与虎尾海马Tlr21保守位点的络氨酸Tyr被苯丙氨酸Phe所替代, 暗示海马基因功能可能与其他鱼类的存在差异。

3.2 线纹海马tlr21基因的组织表达特征

根据已有研究结果可知,在不同种鱼类中的表达模式不同, 牙鲆在鳃和脾脏组织中表达量最高(张洁等, 2015), 大西洋鳕鱼的则主要在肾、肝、鳃和精巢中表达(Sundaram et al, 2012)。斑马鱼的在各组织中均有分布, 肠、脾脏和肾中表达量最高(Yeh et al, 2013)。除了肾和脾脏等常见的免疫器官, 有研究表明, 骨骼肌在鱼类免疫也中扮演重要角色, 比目鱼的骨骼肌中很高(Valenzuela et al, 2017)。荧光定量PCR结果显示,在线纹海马脑、鳃、肝、肾、肠、性腺、肌肉和育儿袋各组织中均有分布, 在肾和鳃中表达量最高。海马的免疫系统存在独特的进化特征, 比如, 海马没有脾脏, 没有典型的头肾, 体表裸露, 没有鳞片和大量黏液包被, 同时肠系膜中缺乏肠淋巴组织, 肾和鳃是海马的主要免疫器官(Matsunaga et al, 1998)。总之, 组织分布结果表明,主要在海马肾脏和鳃中高表达, 也暗示其主要在肾脏和鳃组织中发挥免疫功能。

3.3 线纹海马Tlr21对CpG-ODN的应答特征

Tlr21能够广泛识别RNA和DNA病毒和细菌的侵染, 在先天性免疫中发挥重要作用。CpG-DNA是存在于细菌、病毒和无脊椎动物的DNA中的具有免疫活性的较短的核苷酸序列。这些序列大多含有以去甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)构成的特定结构, 此特定结构即为CpG基序或CpG-DNA。人工合成的含CpG基序的寡聚核苷酸(oligonucleotide, ODN)被称为CpG-ODN。CpG-ODN能够激活机体的Nκ细胞和巨噬细胞, 加强IL-6、IL-2、TNF-γ、TNF-α、IFN-1等多种细胞因子的分泌, 产生炎症反应, 能够增强非特异性免疫反应(Yeh et al, 2013)。因此, CpG-ODN作为免疫佐剂起到诱导机体产生免疫反应来保护机体免受细菌和病毒的感染的作用(Krieg, 2002)。

鱼类同时具有Tlr9和Tlr21两种CpG DNA受体。CpG-ODN的作用在鱼类中与在哺乳动物中相似, 能够活化巨噬细胞, 诱导白细胞增殖(Tassakka et al, 2003; Carrington et al, 2004; Chaung, 2006), 刺激细胞因子的表达(Jørgensen et al, 2003)。例如用含有特征基序GTCGTT的CpG-ODN 2395 (5′- TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG-3′)对大菱鲆进行进行体内感染后, 发现大菱鲆鳃、头肾、体肾和肌肉中的mRNA表达量显著上调(Li et al, 2017)。用含有5′-AACGTT-3′特征基序的CpG-ODN刺激鲤鱼L.的离体培养头肾细胞, 能够激活头肾巨噬细胞的活性, 引起白细胞增殖(Tassakka et al, 2003)。多种CpG-ODN的刺激都可以引起虹鳟鱼离体培养脾细胞和头肾细胞的外周血白细胞的增殖(Carrington et al, 2004)。CpG-ODNs还能间接刺激大西洋鲑鱼白细胞产生抗病毒细胞因子(Jørgensen et al, 2003)。斑马鱼优先识别含有GTCGTT特征基序的CpG-ODN (CpG-2006和CpG-2007), 激活下游免疫通路, 进而引起IFN-γ、TNFb和IL-1的产生, 而以GACGTT为特征基序的CpG-2000和以AACGTT为特征基序的CpG-HC4040的刺激没有引起明显的免疫反应(Yeh et al, 2013)。

注射实验结果表明, 线纹海马肾脏的在注射CpG-2007和CpG-HC4040后表达量明显增加(＜0.05), 注射CpG-2000和CpG-2006的海马肾脏中表达量出现下降(＞0.05), 说明线纹海马的Tlr21对以AACGTT为特征基序的CpG-HC4040和特征基序为GTCCGTT的CpG-2007有识别功能, 而对以GACGTT为特征基序的CpG-2000识别能力不强。根据对免疫应答的不同影响, 研究者把CpG-ODN分为三大类型: CpG-A, CpG-B和CpG-C(Cooper et al, 2008)。A型CpG-ODN以含有CpG二核苷酸的回文序列为核心, 两端为poly G尾, 磷酸二酯键骨架为部分硫代化修饰, 这类CpG-ODN通过回文序列和poly G形成高级结构, 能够活化Nκ细胞和pDC细胞, 诱生大量IFN-α, 对B细胞活化能力有限(Krug et al, 2001; Gürsel et al, 2002; Vollmer et al, 2004)。B型CpG-ODN是全硫代化修饰的线性CpG-ODN, 不能形成二级结构, 对B细胞有很强的刺激活性(Bernasconi et al, 2003), 对Nκ细胞活化能力较弱, 活化pDC细胞产生IL-12和IFN-α的能力也有限(Ballas et al, 1996)。C型CpG-ODN为全硫代化修饰, 能够通过回文序列形成茎环结构和二聚体, 它们兼具A型和B型CpG-ODN的活性, 能够激活B细胞和Nκ细胞, 产生DC IFN-α分泌物(Hartmann et al, 2003; Marshall et al, 2003; Vollmer et al, 2004)。A型和C型CpG-ODN的高级结构可以影响Tlr9的细胞内定位和交叉连接。B型CpG-ODN是使用广泛的免疫佐剂, CpG-2006、CpG-2007和CpG-HC4040都属于B型。在一项关于鸡TLR21功能的研究中发现, 属于C型CpG-ODN的CpG-2429对于鸡TLR21的刺激作用最为明显, B型CpG-ODN CpG-2007的作用次之, 而在小鼠中免疫刺激作用很强的CpG-1826, 对于鸡TRL21的活化能力仅为CpG-2007的一半(Brownlie et al, 2009), 说明CpG-ODN的免疫刺激作用存在物种差异。在我们的实验中, 同为B型的CpG-2006和CpG-2007的特征基序相同, 均为GTCCGTT, 且在序列中都有3个重复, 但是它们对线纹海马Tlr21的刺激作用明显不同。出现这样的结果可能是TLR21对不同类别CpG-ODN的识别存在物种的差异性。

综上所述, 本研究探讨了线纹海马基因的结构和表达模式, 线纹海马与其他鱼类的序列和蛋白质结构都具有较高的相似性,在线纹海马各组织广泛表达, 主要在海马肾脏中高表达; CpG-ODN感染实验结果表明, CpG-2007和CpG-HC4040两个序列能够刺激线纹海马在肾脏中的表达, 说明Tlr21在线纹海马能够通过识别含CpG序列的DNA发挥免疫识别作用。

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The gene structure ofin lined seahorse,, and its responses to CpG-ODN treatment

ZHANG Yuan1, 2, QIN Geng1, ZHANG Bo1, 2, LIN Qiang1, 2

1. Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China

Toll-like receptors (TLRs) are the major pattern recognition receptors (PRR) of the innate immune system in vertebrates, which can initiate host immune responses by recognizing potential pathogens. The present study focused on the role of Tlr21 involved in immune responses in lined seahorse (). The full-length sequence of the lined seahorsegene was cloned. The openreading frame (ORF) of seahorsegene includes 2964base pairs, which is predicted to encode 981 amino acids. The encoding protein had a predicted molecular mass of 246.98 kDa and an estimated isoelectric point of 4.78. Homology comparison and phylogenetic analysis showed that lined seahorse1 shared high sequence identity with its homologs from other species, especially those species in Syngnathidae. Quantitative real-time PCR analysis showed that1 mRNA was widely expressed in various tissues and expressed highest in the kidney. We conducted intraperitoneal CpG-ODNs injections to the lined seahorses. Both CpG-2007 and CpG-HC4040 increased expression levels of1 mRNA in seahorse kidney significantly. In conclusion, these findings indicated thatinitiated the innate immunity in lined seahorse by recognizing CpG DNA.

; gene structure; CpG-ODN; immunity; Lined seahorse; tissue expression difference

2018-04-01;

2017-05-25. Editor: SUN Shujie

National Natural Science Foundation of China (41706178); Natural Science Foundation of Guangdong Province, China (2017A030313214)

P735

A

1009-5470(2019)01-0067-09

10.11978/2018034

2018-04-01;

2018-05-21。孙淑杰编辑

国家自然科学基金项目(41706178); 广东省自然科学基金项目(2017A030313214)

张媛(1993— ), 女, 安徽省淮南市人, 硕士, 从事海洋动物生理与分子生态学研究。E-mail:zhangyuan_scsio@163.com

林强, 研究员。 E-mail: linqiang@scsio.ac.cn

LIN Qiang. E-mail: linqiang@scsio.ac.cn