ATS藻板与自然礁石上藻群生物多样性的比较

王欢欢, 谭斯尹, 王慧, 杜虹, 侯涛, 陈贤建, 黎俊珺, 黄莹



ATS藻板与自然礁石上藻群生物多样性的比较

王欢欢, 谭斯尹, 王慧, 杜虹, 侯涛, 陈贤建, 黎俊珺, 黄莹

汕头大学生物系, STU-UNIVPM藻类联合研究中心, 广东 汕头 515063

ATS(algal turf scrubber)系统是一种利用潮间带藻类高效去除富营养化水体中氮(N)、磷(P)元素的水质净化系统, 藻类是支持整个系统最重要的组成部分, 其群落结构与水质净化效果密切相关。该研究基于Illumina MiSeq平台的高通量测序技术对海水水族缸的ATS系统中藻板样品和自然礁石上的藻类进行多样性分析。18S rDNA研究结果表明, ATS系统中经筛选得到藻类优化序列21390条, 其中对丝藻属占主要地位, 占序列总数的22.79%, 其次19.07%序列归入斜纹藻属; 宋井、展南亭、后宅3个地区的藻类经筛选分别得到88435、87129、106458条优化序列, 主要为分枝色指藻属、宽果藻属和日本马泽藻属。ATS系统和自然环境样品共有的优势藻为骨条藻属和仙菜属。本实验在研究ATS系统与自然礁石上的藻类群落相似性的同时, 深入探究了其群落结构的差异性, 为进一步优化ATS系统的功能提供了理论依据。

ATS系统; 高通量测序; 藻类多样性; 潮间带藻

潮间带藻类过滤法(algal turf scrubber), 简称ATS, 是最早由Adey博士在19世纪80年代提出的一种水处理方法(Adey, 1982)。Smithsonian海水系统实验室的Walter Adey博士将其应用于海水观赏水族缸养殖系统, 通过ATS系统中的潮间带藻类吸收水中的营养, 净化养殖水体(单乐州等, 2014)。作为ATS系统中最核心装置的藻板, 是由潮间带藻类为主构成的微型生态系统, 包括藻类、细菌、真菌和少量浮游生物等。该系统中藻类能快速吸收水体中的氮、磷等营养盐, 维持水质清洁, 还能为水族缸提供微小浮游生物等, 作为珊瑚、鱼类等的饵料, 是一种温和而有效的生态型水处理方法, 特别适合于海水养殖系统的水体净化。近年来, 国内已有公司将ATS系统成功应用于小丑鱼养殖的水体净化(方涛等, 2012; 单乐州等, 2016; 张艳敏等, 2017)。藻板的净水效果与其中藻类的组成以及微生物的群落结构密切相关, 因此, 对ATS系统中藻板上的藻类及微生物多样性研究十分重要。然而, 多数使用者一般只关注于藻板培育的条件摸索, 但对于其生物多样性研究并未有系统性研究。

由于藻类、微生物均存在种类繁多、种属间差异细微以及部分微藻在培养观察中形态容易发生变异等限制因素, 传统的形态学分类法在藻类和微生物的快速鉴定中还存在着许多不足。所以, 近年许多研究者将分子生物学手段应用到藻类和微生物的快速鉴定中(刘京等, 2005)。现代分子生物技术的蓬勃发展为群落多样性、物种丰度提供了越来越丰富的研究方法。高通量测序作为下一代测序技术近年来迅速发展起来, 它具有测序准确率高、耗时短以及信息处理量大等优点, 结合生物信息学的数值分析, 能科学地表征或预测藻类和微生物的群落结构(李克亚等, 2016)。本研究通过MiSeq平台高通量测序分析ATS系统的藻板样品和自然礁石上潮间带藻样品, 比较自然礁石潮间带藻类和ATS系统藻板上生物多样性的不同, 以期获得不同种群的生物多样性特征, 为后续研究ATS藻板上的藻类对营养盐的吸收能力以及优化藻板结构提供理论依据, 同时也为ATS藻板在海水养殖水体净化上的进一步应用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 样本的采集

2016年9月, 在广东省汕头市永亨生物科技有限公司的ATS系统藻类培育室中进行ATS藻板上的海藻采集。利用五点采样法在藻板进行样本采集, 共采集5组藻类样本(该ATS系统引用水体为广东省汕头市南澳县南澳岛的海水)。

2017年5月, 在广东省汕头市南澳县南澳岛的3个不同位置(宋井、展南亭、后宅, 具体地理位置见表1)潮间带的礁石上进行藻类采集, 分别标号为sj、znt和hz, 每组采集3组样本, 共采集9组藻类样本。

1.2 藻类样本全基因组DNA的提取

将采集的藻类用无菌水清洗3次, 用吸水纸吸干, 称取0.1g样品, 在液氮冷冻条件下将样品研磨成粉末状, 使用植物基因组DNA提取试剂盒 (DP305) (天根生化, 北京)提取全基因组DNA, 根据说明书操作。

1.3 全基因组测序

将DNA样品送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行高通量测序及分析, 海藻的基因组的扩增采用18sRNA通用引物对V4F/V4R。

V4F: 5′-GGCAAGTCTGGTGCCAG-3′;

V4R: 5′-ACGGATCTRATCRTCTTCG-3′。

1.4 测序结果分析

1.4.1 数据预处理

将去除嵌合体的序列与数据库代表性序列在美国国家生物技术信息中心 (National Center for Biotechnology Information , NCBI)中的BLAST(https:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)工具进行对比, 剔除低于阈值的序列, 最后得到优质序列。

1.4.2 操作分类单元(Operational Taxonomic Units , OTU)分类

使用QIIME(Quantitative Insights Into Microbial Ecology, http://qiime.org/)软件中的Usearch程序将所有样本按照序列间的距离进行聚类, 然后根据序列之间的97%相似性将序列分成不同的操作分类单元(OTU)。

1.4.3 稀疏曲线的建立

本实验使用97%相似度的OTU, 在Mothur(http:// mothur.org/)软件上用rarefaction.single命令做稀释曲线分析, 利用R(https://www.r-project.org/)软件制作丰富度(richness)和香农(Shannon)指数曲线图。

1.4.4 群落结构图的构建

对OTU聚类结果与对应代表性序列统计结果在属的水平上进行处理, 对于丰度百分比低于1%的物种视为稀少物种, 大于等于1%的物种视为优势物种。然后对优势物种的丰度百分比进行柱状图处理分析。

使用Hemi(https://www.r-project.org/)软件对物种丰度进行属水平的矩阵绘图, 同时热图对样本进行聚类。为了展示效果, 只显示丰度最高的前50个物种分类信息, 其余的物种分类合并成其他(other)。

2 结果与分析

2.1 样本序列信息和多样性指数

从表1可知, 通过各样本的Shannon、Chao1、Simpson多样性指数的对比发现, 总体上看, ATS系统的藻类的数量和种类均多于3个自然地区; 而3个自然地区之间相比较, 发现展南亭的藻类数量和种类最多, 其次是宋井, 最低是后宅, 表明了ATS系统的藻类群落多样性比3个自然地区丰富。

表1 每个样品藻类群落的OTU、丰富度指数、多样性指数和测序覆盖范围

Shannon曲线和稀疏曲线可以反映实验测序深度是否足够大和数据是否合理。图1中a和b说明了OTU数目随着样本序列数的增加, 趋势趋缓, 基本达到平台期, 说明获取了大多数样品信息, 基本能够反映研究样本的藻类群落结构。从图1c和d可以看出, 随着测序数量的增加, Shannon曲线趋向平坦, 说明测序量合理, 测序数据量足够大, 能够反映样本中的绝大多数藻类信息。

图1 自然藻类稀疏曲线(a)、ATS系统藻类稀疏曲线(b)、自然藻类Shannon曲线(c)和ATS系统藻类Shannon曲线(d)

2.2 藻类群落结构分析

根据Sliva数据库对样品18S rDNA测序序列进行比对。从图2可知, 在ATS系统中, 优势藻有对丝藻属、斜纹藻属, 隐藻属、羽纹藻属、海门冬藻属、爬管藻属、骨条藻属、仙菜属、曲舟藻属、红孢囊藻, 分别占总序列数22.79%、19.07%、12.68%、11.17%、9.63%、7.90%、5.92%、4.17%、3.74%、2.93%。优势藻种多数属于红藻和硅藻。其中对丝藻属、海门冬藻属、仙菜属属于大型藻类, 其余的为微型藻类。

在宋井(sj)藻类样本中, 优势藻有分枝色指藻属、石花菜属、日本马泽藻属、纵胞藻属、角毛藻、基扇耳壳藻、骨条藻属、阿米巴藻, 分别占总序列数39.28%、20.75%、12.52%、5.33%、5.24%、4.53%、3.40%、1.68%。其中, 鉴定出非藻类生物马拉色霉菌属和钙质海绵亚纲占5.36%和1.89%。优势藻多属于红藻门和硅藻门。其中石花菜属、日本马泽藻属、纵胞藻属属于大型藻类, 其余的为微型藻类。

在展南亭(znt)藻类样本中, 优势藻有宽果藻属、茎刺藻属、沙哈林藻属、夜光藻属、阿米巴藻、分枝色指藻属、斯氏藻属, 分别占总序列数32.26%、27.24%、18.92%、10.97%、4.15%、2.90%、1.91%。优势藻多数属于红藻门和甲藻门。其中茎刺藻属、沙哈林藻属、分枝色指藻属属于大型藻类, 其余的为微型藻类。

在后宅(hz)藻类样本中, 优势藻有日本马泽藻属、石花菜属、菱形藻属、锥状斯氏藻、仙菜属、角甲藻属、骨条藻属, 分别占总序列数32.72%、26.71%、10.78%、3.18%、2.33%、1.75%、1.34%。其中, 马拉色菌属占13.65%。多数优势藻属于硅藻门和红藻门。其中日本马泽藻属、石花菜属、仙菜属属于大型藻类, 其余的为微型藻类。

图2 属水平上优势藻的群落结构分布图

根据优势藻用Hemi软件制作群落结构丰度图。从图3得知, 自然区域宋井(sj)、后宅(hz)和展南亭(znt)的藻种群落结构具有较大程度的相似性, 三者均含有较大丰度的石莼、细柱藻角毛藻夜光藻和茎刺藻属。ATS系统与3个自然地区的样本在优势藻类上具有一定的相似性, 如这4种藻类群落均包括一定丰度的耳壳藻、沟鞭藻和硅藻, 说明ATS系统中的优势藻种结构与自然环境中的优势藻种结构上相似。另一方面, 在ATS系统中有的藻类在3个自然地区并不存在, ATS系统藻类群落中特有的对丝藻和海门冬藻, 且这部分藻类的丰度都在15%以下, 猜测可能的原因是: 1)公司在制作ATS系统的过程中, 为了平衡藻类结构、增强藻类吸收营养盐的能力而对藻种做出了筛选, 改变了藻类群落结。2)ATS系统的生长环境等因素较为稳定, 附在藻板上的孢子能够生长成为藻类; 而自然礁石上环境相对恶劣, 耐受性差的藻类不能正常生长甚至死亡。

3 讨论

本研究利用Illumina MiSeq高通量测序平台, 对海水水族缸的ATS系统和3个地区的自然礁石进行了藻类生物多样性分析, 对二者的藻类样品进行18S rDNA测序。对ATS系统和3个地区自然礁石上的藻类样品的18S rDNA测序, 最终分别得到21390和282022条优质序列, 二者分别产生842、1083个OUT, 获得的主要藻类群落属于红藻门、硅藻门和甲藻门。

图3 藻类群落在属水平上的丰度热图

Fig. 3 Heatmap of the algal community on the genus level

通过Shannon、Simpson 和 Chao1 多样性指数的比较, 发现ATS系统的藻类多样性比自然礁石上藻类多样性要高, 这也是和ATS系统的作用分不开的。ATS系统是由人为筛选吸收营养盐效率高的藻所组成的微生态结构, 具有较多不同的海藻; 而自然潮间带藻群通常由一个属或种的海藻为主, 其他少数的藻为辅, 因此藻类群落结构比较单一, 所以藻类多样性相对较低, 这有可能是因为自然环境遭到人为的破坏、生存条件比较恶劣所致。三个地区的潮间带藻群中, 展南亭的藻类生物多样性最高, 其次是宋井, 最低是后宅, 这可能与不同海区的盐度、温度、酸碱度等理化条件不同有关。展南亭采样点附近有排污口, 污水的排放导致海水营养盐浓度升高, 有助于藻类在此地生长; 而后宅虽然是个小镇, 居民较多, 但是当地居民在该海区进行大规模的龙须菜、紫菜等海产品养殖, 会导致该区域的营养盐相对较低, 藻类物种也相对单一, 造成藻多样性较低。

比较ATS系统和3个地区自然礁石上的藻类群: 在ATS系统中, 对丝藻属占主要地位, 占序列总数的22.79%, 其次19.07%的序列归入斜纹藻属, 有12.68%的序列属于隐藻属; 而自然礁石上, 分枝色指藻、宽果藻和日本马泽藻占了主要地位, 分别占序列总数的39.28%、32.26%、32.72%; 二者的优势藻多属于红藻门和硅藻门, 共有的优势藻有仙菜属和骨条藻属。Gu等(2017)研究发现, 骨条藻对铵态氮的最大吸收速率大于最大生长速率, 说明骨条藻吸收铵态氮速率更快, 且在其生长阶段可以快速吸收铵态氮, 在自然环境中, 具有较强的适应环境中氮变化的能力以及较强的贮存氮盐的能力。李恒等(2012)发现红藻门中一些大型海藻对水体中硝酸盐和磷酸盐的吸收效果明显, 说明了ATS系统中部分功能藻类源于自然潮间带藻。此外, 在ATS系统上不存在而在自然礁石上存在的其他优势藻, 例如日本马泽藻、角毛藻等, 对营养盐具有较好的吸收效果, 如王翔宇等(2011)研究的6种大型海藻中, 日本马泽藻和孔石莼对氮、磷营养盐的去除能力最强, 且叶片较大的马泽藻去除营养的能力更强。叶志娟(2006)的研究表明, 牟氏角毛藻对不同浓度牙鲆养殖废水中的氨态氮的去除率均达到100％, 硝酸盐、亚硝酸盐、磷酸盐的去除率最高达100％。这启示我们在自然中有许多具有营养盐高吸收效率的潜在藻种, 对其进行深入的研究并应用到ATS系统上, 可进一步提高ATS系统的功能和作用。而对丝藻属、斜纹藻属, 隐藻属、羽纹藻属等均为ATS系统特有的。Lichtlé(1980)发现, 隐藻在繁殖期间的脱包囊阶段需要高强度的光照和高浓度的氮, 这表明隐藻也具有很好的吸收氮的能力。Novoveská等(2016)所设计的大型离岸式光生物反应器, 其原理同ATS系统类似, 其中包含小球藻属、隐藻属及栅藻属等多种微藻, 检测发现可有效吸收废水中75% 的总氮和93% 的总磷。以上研究进一步说明了ATS系统的净水功能是与藻的群落结构和功能相关的, 且受到人们筛选的控制, 表现出不同于自然礁石上藻类群落结构的独特性。

综上, 高通量测序结果展现了ATS系统和自然礁石潮间带藻类在种群结构上的多样性, 其中ATS系统的优势藻主要有对丝藻属、斜纹藻属, 而宋井、展南亭、后宅3个自然海区的优势藻主要为分枝色指藻属、宽果藻属和日本马泽藻属。在属水平上, 二者共有的优势藻有仙菜和骨条藻。同时在研究过程中还发现除了藻类以外的其他微生物种群。近年来已经有研究表明, 藻和菌种群之间存在互作关系(赵以军等, 1996; 沈梅丽等, 2013; 苗祯等, 2016; ), 猜想微生物菌群的存在对藻类吸收营养盐的能力有一定的影响; 但是在本实验中并没有研究藻类功能与微生物菌群之间的联系, 这还有待进一步的探讨。此外，挖掘新的潮间带藻类并将其应用于ATS系统有助于进一步优化ATS系统的净水功能, 对未来实现ATS系统产业化具有积极的意义。

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Comparison of biological diversity of algae on algal turf scrubber (ATS) and natural reefs

WANG Huanhuan, TAN Siyin, WANG Hui, DU Hong, HOU Tao, CHEN Xianjian, LI Junjun, HUANG Ying,

Biology department, Shantou University, STU-UNIVPM Joint Algal Research Center, Shantou 515063, China

Algal turf scrubber (ATS) is a system for water cleaning, which uses intertidal algae to effectively eliminate nitrogen (N) and phosphorus (P) elements in eutrophic water. Algae is the most important organism in the whole system, and its community structure is closely related to the effect of water purification. Based on the high-throughput sequencing technology of Illumina MiSeq platform, we analyze the diversity of algal samples in ATS system and natural reefs in this study. The results of 18S rDNA show that the ATS system obtains 21390 algal majorizing sequences. Among these majorizing sequences,accounts for 22.79% of the total number,and the rest sequences are classified as Psammodictyon, accounting for 19.07%. Algae in Song Jing, Zhan Nantingand Hou Zhai areas have 88435, 87129 and 106458 majorizing sequences after filtering, respectively. They are mainly,and. Both the ATS system and the natural environment samples have the dominant species ofand. This research shows that the ATS system has similarity and specificity in its community structure compared to the natural reefs, which provides a theoretical evidence for further improving the function of the ATS system.

ATS system; high-throughput sequencing; algal diversity; intertidal algal

2018-03-24;

2018-05-14. Editor: SUN Shujie

Special Funds for Scientific and Technological Innovation Cultivation of College Students in Guangdong (pdjh2017a0195)

P735.12

A

1009-5470(2019)01-0043-06

10.11978/2018032

2018-03-24;

2018-05-14。孙淑杰编辑

广东大学生科技创新培育专项资金(pdjh2017a0195)

王欢欢(1996—), 男, 河南省濮阳县人, 本科, 从事潮间带藻类研究。E-mail:14hhwang1@stu.edu.cn

杜虹。E-mail: hdu@stu.edu.cn

DU Hong.E-mail: hdu@stu.edu.cn