京杭大运河通航段水域硅藻分布

吴佳莉，徐国婧，韦笑笑，于艳君，王少杰，任雯丽，崔文，苏潇男

济宁医学院，山东 济宁 272067

硅藻检验技术是溺死诊断、溺水地点推断等法医学实践最常用的检测方法之一[1]。硅藻作为一种广泛存在于水域中的单细胞藻类，对环境十分敏感[2]，其分布具有明显的区域性特征[2-4]。将死者器官中所检硅藻藻属与尸体发现地水域硅藻进行对比，可对溺水地点的判断提供参考。法医学领域已开始致力于建立部分重要水域的硅藻数据库以便在实践中进行查找对比[5]，如北京[6]、苏州[7]的城中水域、珠江流域广东段[8]、长江和嘉陵江重庆主城区段[9]等。京杭大运河通航段（山东济宁—江苏常州）全长约900 km，年通过能力达9.5 亿吨，从古至今都是京杭大运河重要的航运路线。京杭大运河横跨两省，且经过秦岭-淮河一线，从上游到下游不论是气候、降雨量，还是人文环境都具有巨大差异[10]。京杭大运河作为世界上里程最长、工程最大的古代运河，在中国仅次于长江的第二条“黄金水道”[11]，溺亡案件在此水域的发生率也极高，因此具有重大研究价值。本研究拟调查京杭大运河通航段（浙江杭州通航量较少，未纳入本次研究）的硅藻分布规律，建立该水域硅藻数据库，为公安机关侦破案件提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

硝酸（65%～68%，分析纯）、过氧化氢（30%，分析纯）、无水乙醇（分析纯）、甲醛溶液（分析纯）均购自烟台远东精细化工有限公司。

BHW-09A16 消解仪（上海博通化学科技有限公司），HL-6 多联真空抽滤仪（珠海黑马医学仪器有限公司），DiatomScopeTMXL 系统[复纳科学仪器（上海）有限公司]，有机滤膜（直径25.00 mm，孔径0.45 μm，广州益典实验设备有限公司），Multiwave PRO 微波消解系统（奥地利Anton Paar 公司），SBC-12 型离子溅射仪（北京中科科仪股份有限公司）。

1.2 采样点

在京杭大运河通航段（济宁段—常州段）进行实地勘验，随机确定22个采样点，于2021年4月进行水样采集，每个采样点采集1次。采样点具体位置见表1。采样点E、G 附近为微山湖，采样点K 附近为船闸口，采样点L 附近为码头。采样点A～Q 属于温带季风气候，采样点R～V 属于亚热带气候。

表1 各采样点情况Tab.1 Information of each sampling sites

1.3 水样的采集及保存

在各采样点，于运河水面中央水下0.5 m 处取500 mL 水样。水样带回后用5 层医用纱布进行过滤除杂，更换新纱布后重复进行3 次，接着加入25 mL 甲醛溶液于除杂后的滤液，使之固定并存放于阴凉处。

1.4 石墨消解-扫描电子显微镜法

1.4.1 硅藻检验

取5 mL 水样置于消解管中，加入6 mL 硝酸。在BHW-09A16 消解仪中以110 ℃加热1 h，待冷却至室温22 ℃后，加入50 mL 纯水稀释。再采用HL-6 多联真空抽滤仪进行真空抽滤，将硅藻富集于半径8 mm的圆形有机滤膜富集区上，以便最大程度地获得硅藻数量、种类的准确数据。抽滤完毕后，加入50 mL 超纯水，再加入5 mL 乙醇以加速滤膜干燥。将有机滤膜取下烘干，贴在样品座上，SBC-12 型离子溅射仪进行真空喷镀金膜后，用DiatomScopeTMXL 系统分析。

1.4.2 硅藻图像采集并观察

采用抽样调查方法，每个样品随机抽取25%的面积，利用DiatomScopeTMXL 系统（加速电压2.00 kV）在1 500×下对直径8 mm 的每个圆形样品随机抽取1 500 张图像，并根据形态学特征进行人工计数，以采样点所在省份分地区记录硅藻数量、纲目、所属种属以及特征藻属（指仅此采样点拥有，而其他采样点不存在的藻属）。硅藻计数参考文献[12]。

1.5 各类指数分析

计算各采样点硅藻含量（C）、硅藻构成比（Ri）、物种优势度指数（Y）、Shannon-Wiener 指数（H’）、Margalef 指数（dma）、Pielou 指数（J）、Simpson 指数（D），各采样点硅藻含量、硅藻构成比应用SPSSAU v21.0（https://www.spssau.com，北京青丝科技有限公司）进行统计学分析，对物种均匀度（Pielou 指数）和物种多样性指数（Shannon-Wiener 指数）进行t检验，检验水准α=0.05。公式如下：

式中，C表示水样中硅藻的含量，N表示观察到的硅藻总数，V表示水样体积。

式中，i表示某个硅藻种属，Ri表示第i类硅藻藻属占比，ni表示i类硅藻藻属的硅藻数量，N表示观察到的硅藻总数。

式中，ni表示第i类硅藻的数量，N表示硅藻总数。fi表示样品中某类硅藻出现的频率。当Y＞0.02 即为优势藻属。

式中，Pi=，Pi表明第i个种属的相对多度，S表示群落中所有硅藻藻属数量，i表示某个硅藻种属，ni表示第i类硅藻的数量，N表示观察到的硅藻总数。Shannon-Wiener 指数基于物种数量反映群落种类多样性，群落中生物种类增多代表群落的复杂程度增高，即H’值越大，群落所含的信息量越大。

式中，S表示群落中所有硅藻藻属数量，N表示硅藻总数。Margalef 指数反映群落物种丰富度，指一个群落或环境中物种数目的多寡，亦表示生物样品中种类丰富度程度。

式中，Hmax=log2S，Hmax表示最大的物种多样性指数，S表示群落中硅藻藻属数量，H’表示Shannon-Wiener 指数，Pielou 指数代表硅藻群落中各种属分布的相对集中度。

式中，Pi=，Pi表示第i类藻属的相对多度，S表示群落中所有硅藻藻属数量，i表示硅藻种属，ni表示第i类硅藻的数量，N表示观察到的硅藻总数。

2 结果

2.1 硅藻数量

共检出硅藻9 666个。整体看来，各采样点硅藻种属含量有所差异，硅藻数量最多的采样点T（1 564 个）是数量最少采样点O（23 个）的68 倍（表2）。

表2 各采样点硅藻含量Tab.2 Diatom content at each sampling site

2.2 优势藻属

共检出24 种硅藻，分属中心纲、羽纹纲两纲（图1），其中圆筛藻属、冠盘藻属、菱形藻属分别占约16.02%、12.18%和11.30%，位列前三。温带季风气候地区的各采样点（采样点A～Q）检出24 种5 578 个硅藻，优势藻属为圆筛藻属、针杆藻属、舟形藻属、卵形藻属、冠盘藻属、海链藻属、小环藻属、直链藻属、等片藻属、脆杆藻属。亚热带气候地区的各采样点（采样点R～V）检出20 种4 088 个硅藻，优势藻属为圆筛藻属、冠盘藻属、等片藻属、菱形藻属、舟形藻属。采样点Q 不同硅藻藻属（19 种）最多，采样点O 不同硅藻藻属（7 种）最少（图2）。

图1 京杭大运河通航段各采样点主要藻属构成比Fig.1 Composition ratio of main diatoms at each sampling site in the navigation section of Beijing -Hangzhou Grand Canal

图2 各采样点硅藻藻属数量Fig.2 Number of diatom species at each sampling site

各采样点硅藻主要藻属较为一致，采样点A、B、I、J 均具有特征藻属，分别为美壁藻属、弯楔藻属、双眉藻属、窗纹藻属。

从物种优势度指数（Y）发现，各采样点优势藻属以中心纲为主，部分采样点为羽纹纲。

从表3 可见，采样点J、Q 的物种优势度较大，藻属少；采样点N 的物种优势度较小，种类多。

表3 各采样点优势藻属Tab.3 Dominance diatom species at each sampling site

2.3 各生物指数分布

Pielou 指数（J）、Simpson 指数（D）曲线相对平稳，Shannon-Wiener 指数（H’）、Margalef 指数（dma）曲线有一定起伏（图3），其中，船闸口、码头、微山湖附近采样点（即采样点E、G、K、L）的Shannon-Wiener 指数（H’）偏低。

图3 各采样点Pielou 指数（J）、Simpson 指数（D）、Shannon-Wiener指数（H’）、Margalef（dma）指数对比图Fig.3 Comparing diagram of the Pielou（J），Simpson（D），Shannon-Wiener（H’）and Margalef（dma）indexes of each sampling site

3 讨论

由于水体运动、人类活动等一系列因素，尸体发现地点往往并非实际入水地点，因此，对于入水地点的判断成为法医学实践的重要环节。目前能作为溺死地点推断标志物的主要有异物颗粒、硅藻与其他浮游生物（如蓝藻、绿藻等）三大类[18]。在这三者中，硅藻检验拥有较为稳定且能广泛应用的特点，硅藻检验技术从最早的化学消化法，再到酶消化法，到如今最高效的微波消解-真空抽滤-扫描电子显微镜法，呈现日渐成熟的趋势。研究[19]发现，通过建立区域性溺死多发河段硅藻数据库，利用相似系数、差异系数及聚类分析进行落水地点推断具有一定可行性。目前，在刑事案件侦查中，法医通过对溺液中硅藻藻属和数量的检验统计，判断其与实地水样是否一致，已有将硅藻检验用于推断溺亡位置的实际应用案例[20]，南京市公安局在某一河道中发现1 具未知名女童尸体，初步确定漂流范围后，法医工作者选取5 个采样点进行水样采集，计算死者肺组织中优势硅藻群落与5 处水样中硅藻群落的Sprensen 相似系数和平方弦距离，分析硅藻种属构成的相似性，最终排除尸体漂流的可能，推断落水地点即为发现尸体现场附近。

人在溺水过程中必然会挣扎并吸入大量河水进入消化道和呼吸道，进入呼吸道内的溺液最具研究价值[21]。基于硅藻对环境的敏感性，本研究结果显示，各采样点之间优势藻属不尽相同，且优势度也具有一定差异。由于山东省、江苏省所处地理位置特殊，恰巧处于淮河一线两边，而秦岭-淮河一线正是我国南北方地理分界线，两省一南一北，具有鲜明的地理特性，具有研究价值。结合前期研究结果[12]，本研究结果再次印证硅藻在物种丰富度上可能呈由北向南逐渐增加的趋势。部分采样点有特征藻属，如采样点A、B、I、J 的特征藻属分别为美壁藻属、弯楔藻属、双眉藻属、窗纹藻属。在检验中，特征藻属能使检验人员快速识别水样来源河段，从而判断尸体发现地是否为死亡地点。

本研究通过Shannon-Wiener 指数（H’）分析发现，位于船闸口、码头、微山湖这类环境复杂、人流量大的地区的采样点（如采样点E、G、K、L）硅藻藻属可能比较丰富，物种多样性可能较高。过于频繁的人类活动对水体环境产生影响，影响水体中硅藻分布，引起数量和种属的差异。此外，京杭大运河作为我国南水北调工程东线的主要输水渠道，途径江苏省、山东省多地。山东省济宁市、枣庄市属于温带季风气候。在江苏省淮安市淮河苏北灌溉总渠以北的徐州市、宿迁市均为温带季风气候，其以南的扬州市为亚热带季风性湿润气候向温带季风气候的过渡区、镇江市为亚热带季风气候，常州市为亚热带海洋性气候。本研究通过物种优势度指数（Y），确定各采样点优势藻属，经分析发现，属于温带季风气候地区的各采样点（采样点A～Q）硅藻优势藻属以中心纲为主，羽纹纲优势藻属较少；而属于亚热带气候地区的各采样点（采样点R～V）硅藻优势藻属均无中心纲，大多具有共同优势藻属——菱形藻属。即在不同气候带，硅藻分布具有一定藻属差异，后续可以进行深入研究，有助于跨省或者地理位置跨度大的溺水案件的侦查。

本研究由于采样点较少、取样时间单一，可能与实际数据存在一定偏差，后期将增加采样点和采样时间的多样性，以完善相关数据。