褪黑素治疗新生儿缺氧缺血性脑损伤的研究进展

苟知贤，鲁利群

1.成都医学院(成都 610500); 2.成都医学院第一附属医院 儿科(成都 610500)

新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy, HIE)发病率在发达国家为1‰～8‰，发展中国家则高达26‰[1]。我国每年大约新增4～5万名HIE患儿[2]。新生儿缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)是导致新生儿死亡及永久性神经功能障碍的主要原因之一，目前尚无十分有效的治疗方法。近年约15%～25%HIE患儿死亡，超过25%HIE患儿留下永久性神经系统后遗症，如脑瘫、癫痫、精神发育迟滞和视觉障碍[3]。目前，亚低温是唯一被循证医学证实的有效治疗方法，但只适用于足月中重度HIE患儿，且治疗时间窗极短(通常为生后6 h内，3 h最佳)。但受亚低温治疗的HIE患儿仍有近一半留下了后遗症[4]。因此，继续寻求安全有效的治疗方法一直是新生儿科医生努力的方向。近年来，有研究报道褪黑素可通过抗氧化、抗炎和抑制程序性细胞死亡等途径发挥较好的神经保护作用。褪黑素治疗新生儿HIBD的有效性及安全性逐渐受到关注，其可能是有效治疗HIBD的潜在药物。本文就褪黑素治疗HIBD的有效性、安全性及其可能的机制作一综述。

1 褪黑素

褪黑素(melatonin)是一种主要由松果体分泌的内源性吲哚类激素，化学名为N-乙酰基-5甲氧基色胺，于1958年从绵羊松果体分离得到，因其可以改变青蛙肤色而得名[5]。褪黑素在皮肤、视网膜、小脑、肾脏、肝脏、胰腺和卵巢等其他组织器官中也有合成，但合成量通常较少[6]。既往研究[7]认为，褪黑素主要作用于视交叉神经上核中的MT1和MT2受体，参与昼夜节律和季节节律的调节。但近年研究[8]发现，褪黑素具有多种生物学功能，如协调能量代谢、增强免疫、延缓衰老、抗氧化应激和抗炎功能，甚至可抑制癌症的进展。因其具有脂溶性高、易于通过血脑屏障和细胞膜、毒性低等优点，逐渐被认为是一种有前景的神经保护药物，用于治疗各种急性和慢性脑损伤[9]。

2 褪黑素治疗HIBD

2.1 有效性

近年来，越来越多的证据表明褪黑素是有效的神经保护剂，可改善HIBD的预后。Lekic等[10]研究显示，褪黑素是有效的抗氧化剂，可以降低婴儿脑出血后精神发育迟滞和脑瘫的发生率。Husson等[11]研究发现，褪黑素可通过抑制腺苷酸环化酶保护小鼠脑室周围白质免受兴奋性中毒改变，且腹腔注射褪黑素干预可使鹅膏蕈氨酸诱导的白质囊肿(大小)减小82%，提示褪黑素可增强脑白质损伤的修复能力。Pazar等[12]用腹腔注射苯肼盐酸盐(PHZ; 75 mg/kg)诱导的溶血性高胆红素脑病大鼠模型，研究褪黑素的神经保护作用，在第1次和第2次腹腔注射PHZ 0.5 h前及第2次腹腔注射PHZ后24 h分别给予生理盐水或褪黑素(10 mg/kg)治疗，实验结果显示，褪黑素治疗组与生理盐水治疗组相比，大鼠海马区 TUNEL染色阳性细胞数明显减少，表明褪黑素对溶血和高胆红素血症大鼠脑神经元有抗凋亡作用。Aly等[13]进行的一项前瞻性研究共纳入45名新生儿，其中HIE患儿30名，健康对照新生儿15名。将30名HIE患儿随机分为亚低温治疗组(n=15，接受72 h亚低温治疗)和褪黑素/亚低温治疗组(n=15，亚低温治疗72 h+褪黑素10 mg/kg·d，连续5 d)。结果显示，两组患儿血清褪黑素、超氧化物歧化酶(SOD)和一氧化氮(NO)均升高。治疗第5天，褪黑素/亚低温治疗组较单独亚低温治疗组血清褪黑素水平明显升高(P<0.001)，NO明显下降(P<0.001)，每两周随访的脑电图显示癫痫发作减少，MRI显示脑白质异常减轻。在6个月时，褪黑素/亚低温组存活率更高，且无神经系统或发育的异常。这些研究均提示褪黑素可能是治疗HIBD的潜在药物，有望进入临床。

2.2 安全性

人体研究[13]已证明褪黑素的毒性非常低，且副作用可忽略不计，可用于治疗儿童学习障碍、注意力不集中/多动障碍、慢性睡眠障碍及新生儿呼吸窘迫综合症等疾病。动物实验[14]亦表明，即使从孕鼠妊娠6～19 d每天均给予其高剂量的褪黑素(200 mg/ kg·d)干预，对新生大鼠也无任何致畸等副作用。新生仔猪发生HIBD 6h后立即给予褪黑激素30 mg/kg(其为治疗儿童睡眠紊乱剂量的100倍)，仔猪心率、血压等生理指标也无明显改变[15]。然而，有部分学者对褪黑素抑制前列腺素合成及内分泌功能等方面仍有顾虑，且有一项关于接受褪黑素治疗神经损伤时癫痫发作阈值降低的报道[16]。目前，研究中涉及的新生儿数量很少，其治疗HIBD的安全性仍需更多大样本随机对照实验进一步验证[13]。

3 褪黑素治疗新生儿HIBD可能的机制

3.1 抗氧化应激

缺氧缺血可导致神经元线粒体内膜受损，钙通过受体调节通道和电压门控通道流入神经元增多，从而激活脂肪酶、蛋白酶，尤其是花生四烯酸的激活可导致游离脂肪酸的释放，引起还加氧酶激活和前列腺素生成，最后导致超氧自由基的产生[17]。而自由基具有高反应性，且通常引发连锁反应，导致广泛的分子损伤，如脂质过氧化，蛋白质片段化及DNA结构破环等，特别是新生儿不成熟的大脑更易受到自由基的损伤[18]。这可能是HIBD后迟发性细胞死亡的重要原因。

褪黑素被归类为线粒体靶向抗氧化剂，可作为对抗自由基的“防火墙”[19]。且其代谢产物，如5-甲氧基色胺(5-MT)、环状3-羟基褪黑素(c3OHM)、N1-乙酰基-N2-甲酰基-5-甲氧基喹啉 (AFMK)和N1-乙酰基-5-甲氧基喹啉(AMK)及直接前体N-乙酰血清素(NAS)均可单独发挥抗氧化作用[20]。因此，褪黑素及其代谢产物对氧化损伤的保护是连续、良性的过程，可以使多种氧化剂失活，其抗氧化作用可能会随着代谢而增强和多样化。它们主要通过以下途径发挥抗氧化作用：1)通过电子转移、氢转移、自由基加合物形成等途径与自由基直接反应，产生较少的活性物质，避免自由基的连锁反应；2)通过螯合不同的金属离子起到羟基自由基配体失活作用，并显著减少了 Cu(Ⅱ)、Fe(Ⅱ)、 Zn(Ⅱ)、Al(Ⅲ)、 Mn(Ⅱ) 和 β-淀粉样肽相互作用产生的自由基，也可抑制Cu介导的脂质过氧化及Cu(Ⅱ)/H2O2诱导的蛋白损伤；3)通过电子转移再生谷胱甘肽、抗坏血酸等抗氧化物，也可通过电子转移途径将尿苷自由基转移至鸟苷，修复氧化的DNA；4)激活抗氧化酶，抑制促氧化酶，增强DNA的修复[6]。

3.2 抗炎

小胶质细胞是大脑中的常驻免疫细胞，缺氧缺血可导致其激活，并释放促炎因子、促炎介质和趋化因子，这些细胞因子可吸引白细胞至损伤区域，导致炎症的发生[21]。Balduini等[22]研究发现，褪黑素可抑制HIBD大鼠小胶质细胞激活，减少大脑皮质中炎症细胞募集。Radogna等[23]指出，褪黑素可抑制磷脂酶A2(PLA2)、脂氧合酶(LOX)和环氧合酶1(COX-1)等炎症衍生物的激活，从而减轻神经系统炎症反应。另外，Deng等[24]研究发现，褪黑素及其代谢产物(如AFMK、AMK等)均具有抗炎作用，可下调TNF-α、IL-6、IL-8等炎症因子，并抑制环氧合酶和前列腺素的表达。

NO是由一氧化氮合酶(NOS)催化产生的自由基。NOS分内皮型(eNOS)、诱导型(iNOS)和神经型(nNOS)3种。在缺氧缺血早期阶段，再灌注/复氧可激活eNOS和nNOS，从而促进NO的释放。在晚期阶段，小胶质细胞、巨噬细胞和中性粒细胞中的iNOS上调，导致NO持续产生[25]。而 NO在炎症过程中发挥了重要作用。研究[26]表明，在阻断大脑中动脉造成的大脑缺血模型中，褪黑素可下调 nNOS 和iNOS水平、上调eNOS 水平，并减少大脑的梗死体积。在肝脏缺血/再灌注损伤小鼠模型中，褪黑素亦能下调iNOS表达水平及NO产生，降低 TNF-α水平[27]。

3.3 抑制程序性细胞死亡

3.3.1 抑制凋亡 细胞凋亡参与新生儿脑损伤，并在迟发性神经元死亡中发挥重要作用。细胞凋亡从缺氧缺血早期开始，可持续数天至数周。半胱氨酸蛋白酶(Caspase)在细胞凋亡中具有中心作用，而caspase-3在缺氧缺血后成高表达状态。Aridas等[28]在动物实验中发现，缺氧后处理及脐带血细胞治疗可通过抑制Caspase-3的活性来抑制神经元凋亡，从而发挥神经保护作用。研究[29]显示，褪黑素亦可抑制Caspase-3的激活，下调B细胞淋巴瘤2相关的启动子(Bad)和B细胞淋巴瘤2相关的X蛋白(BaX)等促凋亡蛋白，并减少了TUNEL染色阳性神经元数量，从而通过抗凋亡途径发挥神经保护作用。

3.3.2 抑制自噬 自噬是一种自我降解过程，包括去除错误折叠的蛋白质，清除受损的细胞器和病原体。其对维持中枢神经系统中的细胞稳态至关重要。然而，过度的自噬可诱导细胞发生凋亡和坏死。LC3是自噬的特异性标志物，其在HIBD模型皮质神经元胞质中高表达，而褪黑素治疗可显著减少LC3表达阳性神经元的数量。通过免疫印迹技术进一步分析发现，褪黑素显著抑制了LC3-Ⅰ 向 LC3-Ⅱ转化过程[30]。P62是通过自噬-溶酶体途径降解的特异性底物，细胞内P62水平的降低可作为自噬通量的指示。研究[30-31]表明，神经元P62在缺氧缺血12 h后明显降低，而褪黑素可以有效逆转这种降低。这些结果提示缺氧缺血可诱导神经元发生自噬，而褪黑素可以通过抑制自噬发挥神经保护作用。

3.3.3 抑制焦亡 NLRP3炎性小体是由多种蛋白质组成的复合体，通过调节Caspase-1活化，促进pro-IL-1β和pro-IL-18切割成熟，继而引起细胞焦亡。近年的研究发现，NLRP3炎性小体在多种神经系统疾病中起到关键的作用。研究[32]报道，脑缺氧缺血可使NLRP3 表达上调，并激活 NLRP3 炎症体，发生炎性过程。通过体内外实验发现，NLRP3、 Caspase-1的表达在 HIBD 后升高，且 Caspase-1 抑制剂能阻遏神经元死亡，减轻神经系统损伤。Ortiz等[33]研究发现，褪黑素可抑制NLRP3炎症小体的激活，从而对辐射诱导的小鼠口腔黏膜损伤产生良好的治疗效果。此外，Zhang 等[34]在高脂饮食诱导的动脉粥样硬化大鼠模型中发现，褪黑素可通过MEG3/miR-223/NLRP3信号通路抑制血管内皮细胞焦亡，对动脉粥样硬化发挥了良好的治疗作用。

3.3.4 其他 褪黑素可通过调节水肿相关蛋白(如AQP4、ZO-1和Occludin)减轻HIBD后脑和外周组织的水肿[35]。另外，褪黑素可通过PLC/ IP3/ Ca2+信号通路促进脑源性神经生长因子的释放，从而发挥脑保护作用[36]。

4 总结与展望

随着围产医学的发展，新生儿窒息的发生率已明显下降，但因重度窒息而导致的HIBD仍是新生儿死亡及小儿致残的主要原因之一，给患儿家庭和社会带来了严重的精神及经济负担。但HIBD的发病机制十分复杂，可能是能量耗竭、氧化应激和炎症激活等多种因素相互作用的结果，这也是导致HIBD治疗策略发展缓慢的重要原因。近年来，褪黑素以较好的抗氧化、抗炎、抑制程序性细胞死亡及低毒性等多种优良性能逐渐受到广大研究者的关注。此时，进一步研究褪黑素治疗HIBD的有效性、安全性及具体作用机制意义重大。

综上所述，褪黑素可通过抗氧化、抗炎和抑制神经元死亡等多种途径发挥良好的神经保护作用。但目前关于褪黑素与HIBD的研究结果大多来自实验室，且具体机制仍不十分清楚。对褪黑素抗凋亡、自噬及焦亡等神经元死亡机制的进一步深入研究，有可能为治疗HIBD提供新的靶点，同时也为褪黑素进入临床实验提供更多的理论基础。