辛二酰-双羟肟酸对B16黑色素瘤增殖的影响及抗瘤机制研究*

丁小洁，刘 艳，陈 燕，王 理，熊 芬

川北医学院附属医院 皮肤科(南充 637000)

黑色素瘤是一种常发生于皮肤的恶性肿瘤，白种人较有色人种多见。我国黑色素瘤发病率较低，但近年来黑色素瘤发病率也逐渐升高[1]。组蛋白去乙酰化酶抑制剂：辛二酰-双羟肟酸(suberoyl bis-hydroxamic acid, SBHA)能够抑制细胞中组蛋白酶去乙酰化，可选择性抑制肿瘤细胞的生长而对正常细胞无效[2]。本实验研究SBHA对黑色素瘤B16细胞增殖及对细胞内Akt、p-Akt、PTEN 3种蛋白表达的影响，并探讨SBHA的抗肿瘤机制。

1 材料与方法

1.1 仪器与药品

高速冷冻离心机：美国Eppendorf公司；CO2培养箱：日本Sanyo公司；培养瓶、培养皿、6孔培养板：美国Corming公司；胰蛋白酶：美国AMERSCO公司；MTT：武汉生命技术有限公司；胎牛血清：进口分装，美国Thermo Fisher scientific 公司；二甲基亚砜(DMSO)：美国Sigma公司；PBS缓冲液：自配；青霉素和链霉素均购自东北制药股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 黑色素瘤B16细胞来源于ATCC(美国国立细胞库)。将小鼠黑色素瘤B16细胞接种于培养瓶中，使用含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL和链霉素100 U/mL的RPMI-1640培养液，放置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱，湿度相对饱和的条件下培养[3]。B16细胞属于单纯贴壁生长类细胞，换液2 d/次，等到细胞长至瓶壁面积85%左右，用胰酶消化后传代，大约3 d传代1次。取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 药物处理 SBHA以二甲基亚砜(DMSO)溶解后储存于-20 ℃冰箱，储存浓度为10 mmol/L。最终用于细胞的工作浓度中DMSO浓度<0.05%。

1.2.3 MTT法测定细胞增殖能力 采用MTT法检测黑色素瘤B16细胞的增殖能力和细胞活性。黑色素瘤B16细胞种植于96孔板中培养24 h。再分别加入0(空白对照)、20、40、100、200 μmol/L SBHA和等体积的DMSO溶液，然后用培养液调整体积至100 μL， 设置3个重复孔。培养48、72 h后于各孔细胞中分别加入30 μL MTT溶液(5 mg/mL)，吸弃各组细胞的培养液并加入10 μL DMSO进行溶解。在450 nm波长下用全波长酶标仪测定光密度(OD)值，绘制增殖曲线。

1.2.4 Western Blot法分析SBHA对B16细胞Akt、p-Akt、PTEN蛋白表达的影响 收集各组B16细胞，裂解细胞提取蛋白，根据蛋白质的分子量制备不同浓度的SDS-聚丙烯酰胺凝胶，每孔上样量50 g，常规电泳、转膜、封闭，一抗及相应二抗(稀释度1∶500)37 ℃孵育1 h，NBT/BCIP显色30 min。图像经Uyp rdb-it lmage软件采集，Gel works ID advanced V4d软件测定条带的A值，取其与β-actin的比值为相对A值。实验重复3次。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 不同浓度SBHA对B16细胞增殖能力的影响

SBHA作用48 h后，细胞活力随着SBHA浓度增加而下降(P<0.05)；与空白对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。SBHA作用72 h后，对细胞活力的抑制作用明显比48 h抑制作用增强，在给药72 h药物浓度为200 μmol/L时抑制作用达到最大(P<0.05)，IC50值为 (43.50±0.98)μmol/L(表1)。

表1 不同浓度SBHA对B16细胞增殖能力的影响

注：与0 μmol/L(对照)比较，#P<0.05

2.2 不同浓度SBHA对B16细胞Akt、p-Akt、PTEN蛋白表达的影响

不同浓度的SBHA均对B16细胞Akt的表达具有抑制作用，与对照组比较，B16细胞Akt的表达量随着SBHA浓度的增加而呈现下降趋势，且差异有统计学意义(P<0.05)。72 h后B16细胞Akt的表达量下降趋势较48 h后更为明显(P<0.05)。不同浓度的SBHA均对B16细胞PTEN的表达具有促进作用。与对照组比较，B16细胞PTEN的表达量随着SBHA浓度的增加而呈现增长趋势，且差异有统计学意义(P<0.05)；且72 h后B16细胞PTEN表达量的增长趋势较48h后更为明显。不同浓度的SBHA均对B16细胞p-Akt的表达具有抑制作用，B16细胞p-Akt的表达量随着SBHA浓度的增加而呈现下降趋势，且差异有统计学意义(P<0.05)。72 h后B16细胞p-Akt的表达量下降趋势较48 h后更明显(表2)。

表2 不同浓度SBHA对B16细胞Akt 、p-Akt、PTEN蛋白表达的影响

注：与0 μmol/L(对照)比较，#P<0.05

3 讨论

黑色素瘤在临床上较为常见，主要好发于皮肤与黏膜。近年来其发病率增长较快，年增长率3%～5%[4]。据统计2010年全球黑色素瘤新发病例近20万，死亡例数近5万例。以往我国黑色素瘤发病率并不高，但是近年来每年新发病例约2万例，发病率成倍增长，不得不引起我们的重视[5]。一般认为黑色素瘤的发病机制与长时间暴露于日光中的紫外线有关，太阳光中的UVA与UVB可诱导黑色素细胞中的某种基因突变，导致发病。也有研究[6]表明，UVA也可以杀伤免疫细胞，降低人体的免疫功能，从而导致肿瘤的加速形成。但也有很多临床患者，发病部位在平时不能够接受紫外线照射的地方。因此，目前黑色素瘤发病机制尚不明确。

肿瘤从发生、发展到转移整个过程均是多基因、多步骤的调控结果。当细胞中的原癌基因和抑癌基因表达平衡被打乱时，就可能导致细胞过度增殖或细胞凋亡减少。SBHA作为一种组蛋白乙酰化酶抑制剂，能够在真核细胞基因的转录调控中发挥重要的作用，多项研究[7-9]均表明，SBHA对肿瘤的生长具有抑制作用。一项研究[10]发现，不同浓度的SBHA均对细胞的生长有抑制作用，且其能够诱导白血病细胞的凋亡，下调相关凋亡蛋白的表达，抑制白血病细胞的增殖，从而达到抑制肿瘤的目的。杨新苗等[11]在另一项研究中发现，不同浓度的SBHA均能抑制人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231的增殖，并诱导其凋亡，引起比周期G0-G1期阻滞，说明SBHA能够对白血病、乳腺癌等肿瘤细胞发挥作用，抑制细胞的增殖，促进细胞的凋亡，但对于SBHA对黑色素细胞作用的相关研究目前较少。

因此，本实验研究了不同浓度SBHA对细胞的增殖及Akt、p-Akt、PTEN蛋白表达的影响。Akt是PI3K下游的关键效应分子，能够调控细胞周期、激活端粒酶活性、促进血管生成等，在很多肿瘤细胞中均发现了Akt的过度表达，而本次研究发现不同浓度的SBHA对黑色素B16细胞Akt的表达均有一定的抑制作用，且与对照组比较，差异具有统计学意义；除Akt外，黑色素B16细胞中P-Akt的表达含量也有所减少，可能是由于细胞中表达的Akt含量大幅度减少后，所以发生磷酸化的Akt也随之相应减少。PTEN是一种均有磷酸酶活性的抑癌基因，其不仅能够参与凋亡，还具有生长抑制功能，能够促进PIP3去磷酸化，来减弱其信号，从而达到抑制Akt的功能。本研究也发现，随着SBHA浓度的增加，黑色素B16细胞中PTEN的表达含量也随之增加，且与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

综上所述， SBHA能够有效抑制细胞增殖，其机制可能是通过上调PTEN蛋白的表达并抑制Akt、p-Akt蛋白的表达实现的。但本研究对SBHA是否对细胞增殖抑制具有特异性、敏感性和抑制程度等尚没有详细的研究，因此需要更深层次研究证实，希望通过更多多中心研究寻找效果最优、危害最小的抑癌细胞生长药物。