硼酸钠经由非MyD88依赖 HepG2细胞表达IL-6

魏 英，陈琴华，武 伦，袁方均，周文波*

0 引言

肝细胞癌(HCC)是全球第5大常见和第3大致命肿瘤，严重威胁着人类健康。目前全球每年有超过50万人被诊断为肝细胞癌，其发病率逐年增加[1]。尽管目前诊断和治疗技术有所改进，但HCC的5年生存率仍然较低，约为15%(偏远地区仅为2%)[2-3]。HCC为典型的炎症相关性肿瘤，其发生、发展与白细胞介素6(IL-6)等关键炎症因子有关，IL-6对HCC的发生、发展、侵袭和转移起着重要的作用[4]。慢性肝脏炎症时血清IL-6表达升高，而高浓度的IL-6增加HCC的发生率[5]。癌前病变和肝癌干细胞均能自分泌IL-6，这种自分泌的IL-6是肝癌进展的关键[6]。

硼(Boron)是一种非金属元素，在自然界中含量较多，多以硼酸钠(Borax)形式存在，世界卫生组织认为硼是人体的一种必需营养元素，近年来硼在肿瘤治疗及预防方面越来越受重视。课题组在探讨损伤相关的分子模式(DAMPs)对HepG2自分泌IL-6的影响时，偶然发现Borax上调HepG2细胞IL-6 mRNA表达，进一步研究发现，Borax可通过活化p53诱导HepG2细胞凋亡[7]，这种上调IL-6表达的同时又诱导肝癌细胞株凋亡的现象与目前众多文献报道IL-6与肝癌的关系不符，由此引起了我们的关注：Borax上调HepG2细胞IL-6 mRNA表达的机制是什么？本研究在前期基础上用4.0 mmol/L Borax作用不同时间点的HepG2细胞，观察Borax对HepG2细胞自分泌IL-6的影响，并应用siRNA基因干扰技术，沉默HepG2细胞的MyD88基因，探讨Borax对HepG2细胞IL-6表达的影响与MyD88信号通路间的关系。

1 材料与方法

1.1 细胞株及试剂 人肝癌细胞株HepG2(武汉大学典型培养物保藏中心)；Borax(Sigma-Aldrich，221732)；RPMI-1640培养液(美国Gibco公司)；TRIzol Reagent(美国Incitrogen公司)；逆转录试剂(美国Fermentas公司)；ELISA试剂盒(欣博盛生物科技有限公司)；PCR引物(上海生工生物有限公司设计合成)；MyD88-RNAi基因沉默试剂盒(上海吉玛制药技术有限公司)，转染试剂(Therma DharmaFECT 4)。

1.2 主要实验仪器 全波长酶标仪(美国Biotek公司)；CO2培养箱(法国Thermo公司)；荧光定量PCR仪Rotor Gene-6000(澳大利亚Rotor Gene公司)；全波段酶标仪(BioTEK INC，MQX-200)。

1.3 HepG2细胞的培养 用含10%胎牛血清的RPMI-l640培养液，在37 ℃、5% CO2条件下常规培养人肝癌细胞HepG2，当细胞覆盖80%～90%瓶底后，用0.25%的胰酶-EDTA常规消化传代，进行各项实验。

1.4 MyD88基因siRNA干扰片段的筛选

1.4.1 siRNA的设计制备 在GenBank中查到人MyD88 mRNA序列(编号：NM_001172567.1)，选择不同的部位设计了4对MyD88 siRNAs(序列见表1)，并经序列相似性软件比对不与任何已知基因有同源性。MyD88 siRNAs由上海吉玛制药技术有限公司合成。siRNA成品为已退火的冻干粉，使用前用DEPC水配制成20 μmol/L的工作母液。

1.4.2 脂质体介导MyD88 siRNA转染HepG2细胞 在1 OD的siRNA中加入150 μl的DEPC水(公司配送)，得到20 μmol/L的siRNA母液。转染前24 h将细胞接种至6孔板，待细胞长至75%左右进行转染。取2个2.0 ml的EP管，管1取10 μl 20 μmol/L的siRNA加90 μl DEPC水，加100 μl无血清DMEM培养基，室温孵育5 min；管2取4 μl DharmaFECT 4加196 μl无血清DMEM培养基，室温孵育5 min。混合管1、管2，上下颠倒混匀，室温孵育20 min。向上述混合液中加入1 600 μl含10% FBS的DMEM培养基，混匀后加入6孔板。设立空白对照组(Control)、阴性对照组(Negative)、转染试剂组(Reagent)、MyD88-home-316(siRNA-1)、MyD88-home-760(siRNA-2)、MyD88-home-987(siRNA-3)、MyD88-home-1229(siRNA-4)组，各组设置3个复孔。

表1 MyD88 siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、IL-6和GAPDH正义、反义链引物序列

1.4.3 RT-PCR检测转染后MyD88 mRNA的表达情况 转染24 h后，收集细胞，用RT-PCR方法检测各试验组MyD88 mRNA的表达，筛选出MyD88基因siRNA干扰片段。应用TRIzol Reagent总RNA抽提纯化试剂盒抽提细胞总RNA，紫外分光光度计测定A260与A280比值在1.8～2.0范围。应用逆转录试剂盒将总RNA逆转录成cDNA。在稀释至25 ng/μl的cDNA中加入SYBR ®GREEN PCR Master Mix和相应基因扩增引物(序列见表1)，进行RT-PCR检测，反应条件：95 ℃，5 min；60 ℃，20 s；72 ℃，1 min，40个循环。以目的基因域循环数(Threshold cycle，Ct)值对同一样本的内参照基因GAPDH Ct值进行目的基因表达的相对定量分析。

1.5 Barox对HepG2细胞IL-6表达的影响

1.5.1 RT-PCR法检测IL-6 mRNA的表达 将1×105个/ml的HepG2细胞悬液接种于6孔板，每孔1 ml，0、4.0 mmol/L的Borax共孵育5、10、20、30 min，1、2、6、12、24、48、72 h，各组设置3个复孔，收集细胞，用RT-PCR方法检测各试验组IL-6 mRNA的表达情况。

1.5.2 ELISA法检测细胞培养上清中IL-6的分泌量 将1×105个/ml的HepG2细胞悬液接种于6孔板，每孔1 ml，0、4.0 mmol/L Borax共孵育1、2、6、24、48、72 h，各组设置3个复孔，收集培养上清液。按照试剂说明书检测细胞培养上清中IL-6蛋白的含量。

1.5.3 基因沉默技术观察Barox上调HepG2细胞IL-6表达与MyD88间的关系 将1×105个/ml的HepG2细胞悬液接种于6孔板，每孔1 ml，细胞长至75%左右，用筛选出MyD88基因siRNA干扰片段转染沉默MyD88基因。转染24 h后，与4.0 mmol/L的Borax共孵育24 h。设空白对照组、siRNA组、4.0 mmol/L Borax组、siRNA+Borax组，各组设置3个复孔。收集细胞，用RT-PCR方法检测各试验组MyD88和IL-6 mRNA的表达情况，探明Barox上调HepG2细胞IL-6表达与MyD88间的关系。

2 结果

2.1 干扰片段的筛选 与对照组比较，转染24 h后，干扰片段siRNA-1能有效沉默MyD88基因90%以上，干扰片段siRNA-4能有效沉默MyD88基因75%以上，其他干扰片段也能不同程度地沉默MyD88基因，本实验选择沉默效果最好的干扰片段siRNA-1做后续实验。见图1。

图1 MyD88 siRNA干扰片段的筛选

2.2 Borax上调HepG2细胞IL-6 mRNA表达 Borax作用HepG2细胞5 min后，IL-6 mRNA表达即明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；随着Borax作用时间的延长，IL-6 mRNA表达逐渐升高，作用24 h时，IL-6 mRNA表达到达高峰；继续延长Borax作用时间，作用48 h和72 h时，IL-6 mRNA表达逐渐下降，但与对照组比较，IL-6 mRNA表达仍显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)。见图2。

2.3 Borax对HepG2细胞培养上清IL-6蛋白表达的影响 Borax作用HepG2细胞1 h后，细胞培养上清中IL-6蛋白即明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；随着Borax作用时间的延长，IL-6蛋白表达逐渐升高，作用48 h时，IL-6蛋白表达到达高峰；继续延长Borax作用时间至72 h时，IL-6蛋白较48 h下降，但与对照组比较，IL-6蛋白仍然高表达，差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

图2 Borax诱导对HepG2细胞IL-6 mRNA表达的影响

表2 Borax诱导HepG2细胞培养上清IL-6蛋白高表达

2.4 Barox上调HepG2细胞IL-6表达与MyD88间的关系 RT-PCR结果如图3所示，Borax作用24 h对MyD88基因mRNA的表达无影响。干扰片段siRNA-1有效沉默MyD88基因后，加入Borax作用24 h，IL-6 mRNA表达仍显著升高，与单一Borax处理组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

图3 MyD88基因沉默后对Barox上调HepG2细胞IL-6 表达的影响

3 讨论

HCC为典型的炎症相关性肿瘤，其发生发展与IL-6、肝细胞生长因子(HGF)等关键炎症因子有关[8]。IL-6与HCC的关系备受关注，特别是2007年Naugler等[9]证实了IL-6在促成小鼠肝细胞癌方面存在性别差异后，IL-6与肝癌的关系迅速引起了研究界的关注。在酒精性肝炎、乙肝、丙肝、脂肪肝等慢性肝脏炎症时血清中的IL-6浓度增加，而高浓度的IL-6可能导致HCC的发生[5]。血清高水平IL-6预示着慢性乙肝患者将来可发展为HCC[10]。HCC患者血清中的IL-6水平比正常人高很多，三期肝癌患者比一期、二期患者的IL-6水平高很多[11]。目前已有很多学者提出可将循环中IL-6作为HCC的一种肿瘤标记物[12]。

硼在人类新陈代谢中起着重要作用，是生物系统完成生命周期必不可少的元素[13]。有报道，硼具有防治肿瘤的特性，硼的摄入量与一些癌症的发生率呈负相关，提高饮食中硼的含量可降低前列腺癌、乳腺癌、宫颈癌、肺癌等的风险[14-16]。作为抗癌药物，含硼化合物在不能手术的癌症和高恶性肿瘤中的使用逐渐增加，其通过抑制丝氨酸蛋白酶、NADPH-脱氢酶、mRNA剪接、竞争性结合受体结合等多种机制，干扰肿瘤细胞的增殖、诱导肿瘤细胞的凋亡。

硼在肝癌防治方面也有众多进展，研究证实，硼通过抑制氧化应激反应改善暴发性肝衰竭的肝脏病理学变化[17]，通过抑制细胞核增殖抗原的表达抑制化学诱导大鼠肝癌的发生发展[18]，本课题组前期研究发现，硼诱导肝癌细胞株HepG2凋亡[7]。Borax在诱导HepG2凋亡的同时上调了IL-6的表达，体现了IL-6与肝癌关系的复杂性。追溯文献发现，早在1999年，Kang等[19]就提出了不同的观点：将IL-6的cDNA转染到小鼠TIB细胞后移植到小鼠体内，前6周没有生长，相反空转对照细胞在接种后前3周生长飞快，提示IL-6对肿瘤的生长有抑制效应。

免疫细胞产生IL-6有3条主要通路，其中MyD88依赖途径占主导地位。本课题应用基因沉默技术，分析Borax诱导HepG2细胞IL-6表达上调是否与MyD88依赖途径有关。结果显示，4 mmol/L Borax作用5 min后即诱导HepG2细胞高表达IL-6 mRNA，24 h达高峰，随后逐渐降低；siRNA-316沉默MyD88后，对Borax诱导的HepG2细胞IL-6表达上调无影响。结果表明，Borax经由非MyD88依赖途径诱导人肝癌HepG2细胞表达IL-6。

本课题为IL-6与肝癌关系的复杂性提供了实验依据，即IL-6在肝癌的发生发展中可能起到了一把双刃剑的作用，并且为更好地了解Borax的抗肝癌作用提供了研究基础。总之，Borax经由非MyD88依赖途径上调HepG2细胞表达IL-6，但Borax上调HepG2细胞IL-6表达的具体机制及Borax上调HepG2细胞IL-6表达与其诱导HepG2细胞凋亡的关系尚在进一步研究中。