‘东红’猕猴桃花蕾形态与花粉发育时期关系研究

刘 磊，李 薇，宋正江，高本旺

(三峡植物园管理处，湖北 宜昌443000)

猕猴桃隶属于猕猴桃科(Actinidiaceae)猕猴桃属(Actinidia)，为多年生雌雄异株木质藤本植物。猕猴桃属现有54个种和21个变种，共约75个分类群[1]，绝大多数物种分布于中国。猕猴桃驯化栽培被认为是近代果树史上由野生到人工商品化栽培最成功的植物驯化范例[2]。

目前猕猴桃品种选育和遗传改良的主要方法有野生选优、实生选育以及杂交育种等。猕猴桃属植物物种间存在广泛的天然重叠分布区，并且分子系统学研究表明种间普遍存在杂交和基因渐渗现象[3-4]，在此基础上提出了渐渗育种概念(introgression breeding)[5-6]，为猕猴桃属植物杂交育种提供了理论依据。杂交育种是猕猴桃属植物主要育种手段之一，但是对于像猕猴桃这样的木本植物且功能性雌雄异株的植物来说更为耗时费力，很难获得纯合系。

单倍体和双单倍体技术是经济作物品质改良的重要手段，广泛用于植物育种，可以一步获得100%纯系。单倍体可以自然发生，但频率很低，需要人工诱导来满足植物育种的需求。通过发育不成熟的子房、花药或者分离小孢子体外培养的方法可以获得单倍体植株[7]。

花粉胚胎发生能力与小孢子所处的发育时期有着至关重要的关系。一般认为花粉第一次减数分裂到有液泡小孢子至双核早中期易于花粉胚胎发生[8]，可能此时期仍处于小孢子增殖阶段还没有完全分化[9]。Sopory等[10]认为小孢子发育时期可能影响再生植株倍性，其研究表明由单核期小孢子再生而来的植株多为单倍体，而由之后发育时期的花药培养获得的植株染色体数目增多。像砂梨[Pyruspyrifolia(Burm. f.) Nakai〗、印度苦楝(AzadirachtaindicaA.Juss.)和番木瓜(CaricaapayaL.)这样的木本植物选用单核期花药进行植株再生获取单倍体和双单倍体[11-14]。因此，在花药培养之前应进行小孢子发育时期鉴定，以便采集小孢子发育时期适宜的花蕾。

长期以来猕猴桃单倍体育种方面的工作开展较少。猕猴桃花药培养只获得体细胞胚，没有小孢子胚胎发生[15-16]。Chalak等[17]对美味猕猴桃栽培品种‘海沃德’(六倍体)的花粉进行辐射，成功诱导三倍体再生植株。在此之前，Pandey等[18]用辐射的猕猴桃花粉进行授粉，诱导孤雌生殖。总的来说，猕猴桃属植物中单倍体和双单倍技术还没有真正意义上开展。

本研究拟采集不同发育时期猕猴桃花蕾，观察花蕾形态与小孢子发育时期之间的关系，旨在进行猕猴桃单倍体种质创新与育种改良时，可直接根据花蕾形态判断花粉发育时期，提高取材的准确性和效率。

1 材料和方法

1.1 材料

采集三峡植物园管理处(宜昌市林业科学研究所)猕猴桃种质资源圃内中华猕猴桃(ActinidiachinesePlanch.)商业化栽培品种‘东红’雄性花蕾作为实验样品，进行小孢子发育时期的观察。

1.2 方法

2017年3月初，猕猴桃现蕾时开始取样。取材时以花蕾开放程度分为I期、II期、III期、IV期、V期、VI期和VII共7个形态阶段(表1)，每组取15个花蕾。每天早上8:30-9:30，采集雄花花蕾置于冰盒内，带回实验室用卡诺固定液(无水乙醇与冰醋酸体积比为3∶1)于室温下固定24 h，固定液为样品10倍。然后用95%酒精洗去醋酸，于75%酒精4℃保存备用。取固定处理后的花蕾, 用镊子小心剥去萼片、花瓣, 取出花药, 在1 mol L-1HCl 中60 ℃恒温下解离3～6 min, 然后用蒸馏水清洗干净。

将花药放在载玻片上, 滴1滴1.5%醋酸洋红染色液, 用双面刀片从花药中部切断, 用镊子轻轻挤压花药, 使其散出花粉母细胞或花粉粒, 去掉花药壁残渣, 加盖盖玻片, 在酒精灯火焰上微烤2～3次，45%醋酸分色制片。用奥科巴斯BX43型生物数码显微镜先在100×下找到视野, 再在400×下确定花药小孢子所处的发育时期并拍照。

2 结果和分析

2.1 小孢子发育时期

通过对I～VII时期花蕾的显微观察，检测到单核期中期、单核靠边期、双核期和三核期花粉(图1)。因选取试验材料时期局限性，本研究未观察到小孢子母细胞时期、二分体时期及四份体时期等花粉早期的发育状态。

2.2 小孢子发育时期与花蕾外部形态特征、花蕾大小的关系

小孢子处于单核期花蕾处于Ⅰ期和Ⅱ期，花蕾紧实被花萼片紧紧包裹，花萼稍有松动，花瓣稍露(图2)。Ⅰ期花蕾花瓣和花萼平均长度分别为0.80 cm和0.50 cm，花瓣长和花萼长比值为1.59，有84.4%小孢子处于单核期，其中单核中期有32.4%，单核靠边期有52.0%；Ⅱ期花蕾花瓣和花萼平均长度分别为0.85 cm和0.51 cm，花瓣长和花萼长比值为1.67，有68.6%小孢子处于单核期，其中单核中期有37.3%，单核靠边期有31.3%(表1)。

Ⅲ期和Ⅳ期花蕾的小孢子大多处于双核期，此时花蕾仍较为紧实，花萼片松动较多，花瓣裸露面积增大但仍平整未展开(图2)。Ⅲ期花蕾花瓣和花萼长分别为0.87和0.48，二者比值为1.82，此时小孢子有62.0%处于双核期；Ⅳ期花蕾花瓣和花萼长分别为0.87和0.46，二者比值为1.89，此时小孢子有75.4%处于双核期(表1)。

图1 猕猴桃小孢子不同发育时期图片 A：单核中期；B：单核靠边期；C：双核期；D：三核期

表1 猕猴桃花蕾大小及小孢子发育时期统计

V期、VI期、VII期小孢子细胞大多处于三核期(图2)，基本发育为成熟花粉，所占比例分别为63.8%、85.3%和84.5%。V期花蕾花萼片基本打开，花瓣平整或稍有松动；VI期花瓣松动较多，有2～3片花瓣松动；VII期处于铃铛花时期，花瓣3～4片松动。V期、VI期、VII期花瓣长度大于1 cm，花瓣和花萼长度比值均大于2。

表1数据显示，在小孢子发育阶段，花蕾花萼长度基本没有增长，花瓣长度逐渐增长。花瓣和花萼长度比值为1.59～1.67时，小孢子发育时期多处于单核期；花瓣和花萼长度比值为1.82～1.89时，小孢子发育时期多处于双核期；当花瓣和花萼长度比值大于2时，小孢子发育时期处于三核期，为成熟花粉。

3 讨 论

目前单倍体育种主要通过发育不成熟的子房、花药或者分离小孢子体外培养的方法可以获得单倍体植株，而选择适宜小孢子发育时期是单倍体取得成功的重要因素之一。王玉英等[19]在花药培养时对比了单核早期、单核靠边期和双核期，指出了对大多数植物而言，单核靠边期的效果是最佳的。Ranjith Pathirana等[20]研究表明处于小孢子发育单核中期到后期的三花龙胆(GentianatrifloraPall.)花药可再生出单倍体或双单倍体。在胡萝卜(DaucuscarotaL.)小孢子培养过程中，通过花蕾大小和形态选取小孢子发育阶段处于单核晚期或者双核早期的花药分离小孢子进行小孢子培养[21]。一般认为花粉第一次减数分裂到有液泡小孢子至双核早中期易于花粉胚胎发生[22]。因此，花药培养或小孢子培养获得单倍体或双单倍体首先在材料选择上极其重要。通过显微镜逐个观察小孢子发育时期很困难，确定小孢子发育时期与相对应的花器官外部形态指标间的联系至关重要。

图2 不同阶段花蕾形态特征描述

猕猴桃是一种重要的水果资源，目前猕猴桃在单倍体育种方面的研究工作开展较少，即使有少量关于猕猴桃花药培养方面的文章但是只是获得了体细胞胚，并没有小孢子胚胎发生过程。在砂梨[Pyruspyrifolia(Burm.f.)Nakai]、印度苦楝(AzadirachtaindicaA.Juss.)和番木瓜(CaricapapayaL.)等木本植物中选用单核期花药进行植株再生获取单倍体和双单倍体[11-14]。因此，在猕猴桃花药培养获得单倍体的研究中，首先要确定猕猴桃小孢子发育时期和花蕾形态特征间的联系，便于今后单倍体育种研究的材料选择。

孙守如等[23]研究结果表明南瓜花蕾形态与小孢子发育时期存在密切关系，依据花蕾纵横比可判断小孢子发育时期。孙治强等[24]认为，茄子同一品种花蕾长和花蕾直径有一定规律，其小孢子发育时期与萼裂基部差有一定关系。在西瓜花药和小孢子培养中，通过确定花蕾发育和花粉发育时期的关系，找到西瓜单核靠边期花粉相对应的西瓜花蕾的形态特征[25]。上述研究结果表明，花蕾形态特征与小孢子发育时期有着密切的联系，可以作为花药培养或小孢子培养的取材依据。在猕猴桃中，其花蕾形态特征与小孢子发育时期的关系还未见报道。

从研究结果发现，猕猴桃小孢子发育时期与花蕾形态特征及花瓣与萼片长度比值存在密切关系。所以在猕猴桃单倍体育种取材过程中可先根据花蕾的形态特征，即花萼松动和花瓣裸露大小进行初步判断，然后再以花瓣和花萼长度比值进行进一步筛选，以此提高猕猴桃小孢子取材的准确性。

植物的花粉发育不但容易受到环境的影响，而且不同品种、不同倍性小种间的花蕾形态和花粉发育情况也存在差异。因此，猕猴桃花蕾形态特征与小孢子发育时期间的相关性仍有待进一步深入研究。