脐带间充质干细胞移植对大鼠脊髓损伤区域神经损伤的修复效果分析

吴玲玲 潘晓明 陈浩浩 傅晓艳 王文倩 江文娇 张辉 丁明星

【摘要】 目的：探究臍带间充质干细胞（UMSCs）移植对大鼠脊髓损伤区域神经损伤的修复效果。方法：选择70只大鼠，雄性，体重220～260 g，采用随机数字法分为研究组和对照组，各35只。两组大鼠均采用脊髓半切建模。建模1周后研究组行UMSCs移植，对照组给予等量不含干细胞0.9%氯化钠溶液注射。移植24 h及1、2、4周后，比较两组Tarlov评分。移植2周后，观察两组的组织学情况，比较两组血清白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平。结果：移植24 h后两组Tarlov评分均较低，差异无统计学意义（P>0.05），移植1、2、4周后研究组Tarlov评分均明显高于对照组（P<0.05）。移植2周后，对照组大鼠脊髓组织学检查发现，脊髓空洞面积大，神经纤维相对稀疏，存在不同程度的炎性细胞浸润且星型胶质细胞明显聚集增生;研究组炎性细胞浸润且星型胶质细胞与对照组比较明显降低，且有神经纤维通过大鼠脊髓损伤区域。研究组移植2周后两组IL-1比较，差异无统计学意义（P>0.05），研究组IL-6和TNF-α水平均明显低于对照组（P<0.05）。结论：采用UMSCs在一定程度上可以减轻大鼠损伤脊髓部位的炎性细胞浸润、抑制胶质细胞形成瘢痕组织，对于改善大鼠神经损伤后功能的恢复有着重要意义。

【关键词】 脐带间充质干细胞 移植 脊髓损伤

[Abstract] Objective： To investigate the repair effect of umbilical cord mesenchymal stem cells （UMSCs） transplantation on nerve injury in rats with spinal cord injury. Method： A total of 70 rats were selected， males weight was 220-260 g. They were divided into study group and control group according to the random number table method， 35 rats in each group. Both groups were modeled by spinal cord semisection. One week after modeling， the study group was given UMSCs transplantation and the control group was given equal amount of 0.9% sodium chloride solution injection without stem cells. The Tarlov scores were compared between the two groups 24 h， 1， 2 and 4 weeks after transplantation. Two weeks after transplantation， the histology of the two groups was observed and the serum levels of interleukin-1 （IL-1）， interleukin-6 （IL-6） and tumor necrosis factor-α （TNF-α） were compared. Result： Tarlov score was lower in both groups 24 h after transplantation， the difference was not statistically significant （P>0.05）. The Tarlov score of the study group was significantly higher than those of the control group after 1， 2 and 4 weeks of transplantation （P<0.05）. Two weeks after transplantation， histological examination of the spinal cord in the control group showed that the area of the spinal cavity was large， the nerve fibers were relatively sparse， there were inflammatory cell infiltration of different degrees， and astrocytes were obviously clustered and proliferated. In the study group， inflammatory cell infiltration and astrocytes were significantly lower than those in the control group， and nerve fibers passed through the spinal cord injury area of the rats. There was no significant difference in IL-1 between the two groups 2 weeks after transplantation （P>0.05）. And IL-6 and TNF-α levels in the study group were significantly lower than those in the control group （P<0.05）.Conclusion： UMSCs can alleviate the inflammatory cell infiltration at the site of spinal cord injury in rats and inhibit the formation of scar tissue in glial cells， which is important to improve the recovery of function after nerve injury in rats.

[Key words] Umbilical cord mesenchymal stem cells Transplantation Spinal cord injury

First-authors address： Medical Molecular Biology Laboratory of Jinhua Polytechnic， Jinhua 321007， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.30.008

人臍带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UMSCs）是除了造血干细胞（hematoporetic stem cell，HSC）以外的另一类具有高度自我更新和多向分化潜能的干细胞，具有来源丰富，采集方便，供者无痛苦，移植后急性移植物抗宿主病发生率低等特点[1-3]。中枢神经系统（central nervous system，CNS）损伤后对于其修复的研究，目前仍是医学界研究的热点，特别是间质干细胞在机体神经组织损伤后的修复和再生上有着重要的作用，也引起越来越多的关注[4-6]。本次研究旨在分析通过在体研究，来进一步关注将脐间充质干细胞移植到脊髓损伤的大鼠后，观察移植后其存活、分化情况及其神经功能的恢复情况，为临床上细胞移植在治疗脊髓损伤提供一定的科学依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选择70只大鼠，雄性，体重220～260 g，由浙江省实验动物中心提供，动物许可证号为SCXK（浙）2014-0001。采用随机数字表法分为研究组和对照组，各35只，两组大鼠均给予了脊髓左侧半切，建立脊髓损伤模型。

1.2 方法 移植标记及模型建立：本研究所用脐带组织为健康产妇自愿捐赠，由金华市思丹姆干细胞生物科技有限公司提供。移植标记：对于UMSCs首先在体外进行培养，培养融合时，向其加入Brdu（Sigma公司），10 μg/mL，加入后继续培养72 h，在对大鼠进行移植前在给予胰蛋白酶（美国Gibco公司）消化，分别经离心、洗涤后将其稀释成为悬液进行备用。模型建立：采用戊巴比妥钠（30 mg/kg）对大鼠进行腹腔注射麻醉，麻醉后以大鼠的T10为中心，对其进行解剖，剥离大鼠脊椎两侧的椎旁肌，剥离大鼠脊椎椎体的硬膜，暴露T9～11的棘突和椎板，暴露出该阶段的脊髓，采用外科显微镜将脊髓半切至脊髓后正中静脉右缘。干细胞移植：研究组在给予脊髓半切1周后在行UMSCs移植。UMSCs的移植主要采用单细胞注射器进行，将其注射到大鼠脊髓损伤的附近区域，细胞数量不少于1×109个。对照组大鼠建模1周后给予等量不含干细胞生理盐水注射。

1.3 观察指标与判定标准 （1）比较两组神经功能评分。在移植后24 h和1、2、4周分别进行Tarlov评分，分值0～7分，其得分越低，说明功能障碍越严重。（2）组织学变化观察，观察移植2周后两组经再次麻醉取材其T4～L1段脊髓，再行HE染色观察大鼠损伤区域恢复情况。（3）比较两组炎症因子水平。移植2周后，采集大鼠静脉血2～3 mL，将其置于抗凝管内，利用酶联免疫法检测血清白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平，以上操作均严格按照试剂盒说明书进行。

1.4 统计学处理 采用SPSS 21.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，组间比较采用独立样本t检验;计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组Tarlov评分比较 移植24 h后两组Tarlov评分均较低，差异无统计学意义（P>0.05）;移植1、2、4周后研究组Tarlov评分均明显高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 两组组织学观察 移植2周后观察对照组大鼠脊髓组织学检查发现，脊髓内灰白质界限不清，空洞面积大，见空泡样坏死灶、神经纤维相对稀疏、混乱，存在不同程度的炎性细胞浸润且星型胶质细胞明显聚集增生;而研究组大鼠移植2周后其炎性细胞浸润且星型胶质细胞与对照组比较明显降低，且有神经纤维通过大鼠脊髓损伤区域。

2.3 两组相关炎性因子比较 移植2周后两组IL-1比较，差异无统计学意义（P>0.05）;研究组IL-6和TNF-α水平明显均低于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2。

3 讨论

以往研究认为，CNS中神经细胞一旦发生损伤后，往往不能再生。但近年来，随着医疗技术的不断发展进步和UMSCs移植这一概念的提出，对于各种干细胞及其可塑性的相关研究为干细胞修复神经系统带来了希望[7-8]。其主要是由于干细胞有着很轻的自我更新能力，目前相关研究证实，利用神经系统的细胞对其进行移植，其在一定程度上可以促进神经损伤的恢复。采用UMSCs进行移植具有以下优点，第一，免疫原性相对较低，发生免疫排斥的反应要低很多，第二，其在获得上和扩增上相对比较容易;第三，其可塑性相对较好，能够分泌营养因子来调节损伤部位的微环境[9-10]。

目前在临床上采用细胞或组织移植进行脊髓损伤的治疗，已经成为主要治疗手段之一，这也国内外相关学者所证实的一样，UMSCs不仅可以对缺失神经组织进行填充，其还可以通过分泌营养因子、增加损伤血管增生，减少缺血损伤[11-12]。通过对神经胶质细胞、促炎和抗炎细胞因子的作用，靶向鞘内移植可以缓解脊髓损伤后的神经病理性痛[13-14]。我国学者利用未经处理的UMSCs将其移植到脊髓半切损伤的大鼠后，发现其不但能够长期存活，还具有促进轴突再生的作用[15-16]。也有学者发现其可以促进大鼠神经纤维的恢复[17]，本次研究也证实了这一点。目前关于细胞移植的相关实验众多，但关于移植细胞浓度以及移植时间的研究或文献缺乏，不同浓度与不同移植时间是否对脊髓损伤的修复有所影响，还需要进一步证实[18]。炎性因子IL-6由淋巴细胞、上皮细胞、巨噬细胞分泌，是一种急性期炎症的重要细胞因子，具有抗病毒以及促使中性粒细胞生成和释放弹性蛋白酶的作用[19-21]。本研究结果显示，研究组IL-6、TNF-α炎性因子水平均明显低于对照组（P<0.05），这也在一定程度上说明了UMSCs移植不仅对大鼠脊髓损伤区域神经损伤的修复效果较好，对其降低其体内炎性水平也有重要意义。

总之，本次研究认为，采用UMSCs移植在一定程度上可以减轻大鼠损伤脊髓部位的炎性细胞浸润、抑制胶质细胞形成瘢痕组织，对于改善大鼠神经损伤后功能的恢复有着重要意义。由于本次样本量相对较少，在下一步探究中还需加大样本量行进一步探究分析。

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（收稿日期：2019-08-12） （本文編辑：田婧）