不同检测指标对早期筛查结核性胸膜炎粘连的价值

唐怡敏 张娟娟 叶涛生 张国良 刘映霞

结核性胸膜炎是最常见的胸膜疾病之一，占胸腔积液性疾病的30%～60%[1]。结核性胸膜炎常见的并发症为胸膜肥厚粘连、胸腔积液形成，如果经久不愈，将出现胸廓塌陷、肺不张、脓胸、支气管胸膜瘘等严重并发症，直接影响患者生存质量。故早期诊断结核性胸膜炎胸膜粘连程度，对进一步诊治及患者预后有着重要意义。笔者通过对结核性胸膜炎患者外周血和胸腔积液的常规及生化检查，统计分析结核性胸膜炎粘连程度与临床指标的相关性，寻找可能预测结核性胸膜炎患者胸膜粘连的早期临床指标，以提高临床防范胸膜粘连的意识和方法。

对象和方法

一、 研究对象

1.一般资料：选取2015年3月至2017年3月深圳市第三人民医院呼吸科确诊为结核性胸膜炎、病程超过1个月、未进行规范抗结核药物治疗的134例患者，排除免疫系统疾病、糖尿病、恶性肿瘤、人类免疫缺陷病毒(HIV)感染，以及严重心、肝、肺、肾脏等疾病。

134例患者中，男72例(53.73%)，女62例(46.27%)；年龄16～63岁，平均(35.05±14.06)岁。依据内科胸腔镜下胸膜粘连程度分为无胸膜粘连者32例(23.88%，无粘连组)和胸膜粘连者102例(76.12%，粘连组)。入院后行外周血和胸腔积液常规检查[包括C-反应蛋白(CRP)、血红细胞沉降率(ESR)]、生化指标检测[包括腺苷脱氨酶(ADA)、乳酸脱氢酶(LDH)、单核细胞百分比(MONO%)]、酶联免疫斑点检测(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)；以及使用CT扫描测量胸腔积液和胸膜的厚度，并对结果进行分级评分[2]。

2.结核性胸膜炎确诊依据[2]：(1)胸腔积液和胸膜活检行结核分枝杆菌培养阳性；(2)胸腔镜取胸膜活检发现肉芽肿，结合临床症状及病理、生化检查提示结核病。二者有其一即可。

二、研究方法

1.内科胸腔镜检查：采用内科胸腔镜检查技术，从上至下、由近而远的对壁层和脏层胸膜、横膈和纵隔面进行全面检查，对胸膜粘连进行定量判定；并选取可疑部位直视下多点位3～5块壁层胸膜活体组织送检病理检查。

胸膜粘连判定方法如下[2-5](图1～5)：0级：胸膜见充血肿胀，散在结节，但胸膜腔内均无胸膜粘连；1级：整个胸膜腔内见1～3条经牵拉即可分离的疏松且薄的胸膜粘连带；2级：胸膜腔1个区域内有3条及以上粘连带，钝性即可分离的胸膜粘连，整个胸膜腔可以显露；3级：胸膜腔的每个区域均有散在的粘连带，部分胸膜腔粘连不能显露，分离胸膜粘连时可出现胸膜出血或损伤；4级：大部分胸膜腔由于粘连而闭合，仅能显露小部分胸膜腔，分离胸膜粘连时可出现胸膜出血或损伤。0级为正常胸膜，1～2级为轻度胸膜粘连，3～4级为重度胸膜粘连。本次统计分析将0级归为无胸膜粘连组，将1～4级归为有胸膜粘连组。

2.外周血和胸腔积液结核免疫方法(PBMC-ELISPOT和PFMC-ELISPOT)[6]：ELISPOT法主要检测结核分枝杆菌特异性抗原A(ESAT-6：早期分泌抗原靶分子)或多肽Peptide体外刺激T细胞后γ干扰素(IFN-γ)释放水平。

首先采集患者的外周血和胸腔积液标本，于2 h内常规分离单个核淋巴细胞(分别为PBMC和PFMC)，随后加入一定量的1640培养基，将细胞浓度调整为2×106/ml。取100 μl细胞悬液加入到已包被IFN-γ单克隆抗体的96个孔板中，每个样本对应4个孔，阳性对照孔中加入10 μl植物血凝素(PHA)做对照[即用无血清培养基或磷酸盐缓冲液(PBS)配制成50 μg/ml]，终浓度为10 μg/ml；阴性对照中只加培养基，A抗原孔加入10 μl ESAT6抗原，B抗原孔加入10 μl Peptide抗原。孵育条件：37 ℃，5%CO2，时间 14～16 h。第2天洗板后，加入100 μl检测抗体于CO2培养箱孵育1 h，洗板后再加入100 μl亲和素继续于CO2培养箱中孵育1 h，继而洗板，最后加入显色剂显色。E6和peptide刺激PBMC和PFMC细胞产生PBMC-ELISPOT-E6(简称“PBMC-E6”)、PBMC-ELISPOT-peptide(简称“PBMC-peptide”)、PFMC-ELISPOT-E6(简称“PFMC-E6”)、PFMC-ELISPOT-peptide(简称“PFMC-peptide”)免疫复合物，所释放的IFN-γ水平待显色洗板后最终以斑点的形式出现，通过手动计数斑点数量或者通过ELISPOT斑点读版仪获得以上4组免疫复合物数据(单位是SFCs/孔)，进行统计分析。

3.细菌学检测：(1)抗酸杆菌萋-尼染色法[7]：混匀胸腔积液标本并取0.05～0.1 ml均匀涂抹在载玻片，烤干后滴加石碳酸复红染液，待干燥后滴加脱色剂，用蒸馏水清洗后再次滴加亚甲蓝染料，待干燥后镜下观察细菌的数量，以判定是否阳性。(2)MGIT 960液体培养[8]：胸腔积液离心3000×g15 min，向沉淀中加入1 ml PBS，取0.5 ml样本接种到已经准备好的MGIT培养管和BacT/ALERT培养瓶，将培养样本置于BACT/MGIT 960 3D全自动培养箱(37 ℃恒温培养箱)中进行培养。

4.血常规及生化检测：(1)ADA、LDH、CRP、MONO%测定[9-10]：严格按照测定试剂盒中的说明书，采用全自动血常规检测仪器进行测定。(2)ESR测定：严格按照《全国临床检验操作规程》第3版[11]中ESR测定的方法进行检测并记录其结果。

5.CT测量胸腔积液和胸膜厚度的分级及评分标准[2]：对CT检查中的7种征象(结节、微结节、实变、支气管损伤、磨玻璃样病变、空洞、间质损伤)采用5级评分法进行评分。其中0级：没有大阴影，记为0分；1级：全部大阴影的面积不超过该层面的1/4，记为1分；2级：全部大阴影的面积占该层面的1/4～1/2，记为2分；3级：全部阴影的面积占该层面的1/2～3/4，记为3分；4级：全部大阴影的面积超过该层面的3/4肺受累，记为4级。所得评分相加即为总分。

三、统计学处理

结 果

一、 两组患者各检测指标情况

通过两组间多个指标的比较，发现胸膜粘连组患者胸腔积液中的LDH和ADA水平均明显高于无粘连组患者，差异均有统计学意义(P值均<0.05)；而其他检测指标与患者后期胸膜粘连的程度均差异均无统计学意义(P值均>0.05)(表1)。

二、 ADA、LDH检测水平对结核性胸膜炎早期筛查胸膜粘连的检测效能

通过Graphpad软件对有统计学意义的ADA、LDH检测水平进行ROC曲线分析，绘制ROC曲线确定ADA、LDH值在诊断结核性胸膜炎胸膜粘连时曲线下面积(95%CI)分别为0.84(0.76～0.93)、0.89(0.82～0.96)，数值均接近“1”，说明胸腔积液中ADA、LDH数值对于诊断结核性胸膜炎后期胸膜粘连具有较高的诊断价值。以ROC曲线上约登指数最大切点(分别为0.63、0.58)所对应的ADA、LDH数值(分别为62.85 U/L、393.50 U/L)作为结核性胸膜炎后期胸膜粘连诊断的最佳临界点，其所对应的检测敏感度和特异度分别为 81.30%和81.82%、84.35%和73.68%(图6～9)。

表1 各检测指标在两组患者中的水平分布

图6 胸腔积液中ADA值与结核性胸膜炎后期胸膜粘连的关系散点图 图7 胸腔积液中ADA值与结核性胸膜炎后期胸膜粘连的关系ROC曲线图 图8 胸腔积液中LDH值与结核性胸膜炎后期胸膜粘连的关系散点图 图9 胸腔积液中LDH值与结核性胸膜炎后期胸膜粘连的关系ROC曲线图

图6、7使用Graphpad软件处理显示胸腔积液中ADA值与结核性胸膜炎后期胸膜粘连的关系。图6为散点图，可见ADA在结核性胸膜炎后期出现胸膜粘连组中比无粘连组中明显增加；图7为ROC曲线图，可以看到利用ADA在诊断结核性胸膜炎后期是否发生胸膜粘连有较高的敏感度和特异度。

图8、9使用Graphpad软件处理显示胸腔积液中LDH值与结核性胸膜炎后期胸膜粘连的关系。图8为胸腔积液中LDH在粘连组和无粘连组中的散点图，可见LDH在结核性胸膜炎后期出现胸膜粘连组中比无粘连组中明显增加；图9为ROC曲线确定LDH在诊断结核性胸膜炎后期胸膜粘连中的敏感度与特异度，可见利用LDH诊断结核性胸膜炎后期是否发生胸膜粘连有较高的敏感度和特异度。

讨 论

胸膜肥厚粘连是由于结核分枝杆菌及其代谢产物作用于胸膜而发生炎症，使胸膜毛细血管壁通透性增加，壁层胸膜与脏层胸膜产生较多液体，大量纤维蛋白及血细胞渗入到胸膜腔液体中，形成胸腔积液；随着病程的迁延，纤维蛋白沉积在胸膜上，形成膜样分隔或包裹性胸腔积液[12]。

正常情况下，胸腔尖顶区的壁层胸膜产生少量的液体有利于肺的扩张及减小呼吸时产生的摩擦，通过胸腔最基底区的膈面和纵隔面壁层胸膜上的淋巴管微孔进行重吸收，两者保持动态平衡[13]。当发生结核性渗出性胸膜炎时，其脏、壁层均生成较多液体进入胸膜腔，由于胸腔内肉芽组织、干酪样坏死物影响了淋巴管微孔对感染性胸腔积液的吸收能力，引起动态平衡紊乱，导致胸膜腔内渗液急剧增多，纤维蛋白也随之增加，胸膜粘连、增厚的风险也随之加大，且随炎症的加重而愈发明显；当发生结核性干性胸膜炎时，反复的感染和炎症刺激可导致治疗效果不佳的包裹性胸腔积液，特别是多房性包裹性积液的大量产生，最终可导致胸膜增厚、钙化，甚至形成脓胸、支气管胸膜瘘，严重者还可出现肺膨胀不全、支气管扩张等不可逆改变，以及重度胸廓塌陷、胸廓畸形等限制性肺功能障碍，严重影响患者的健康水平和生命质量。

胸膜增厚粘连早期可通过胸部CT扫描来判断[14]，近年来也有学者用超声来评估，但两种方法敏感度均较低，且不直接，易受仪器和主观判断干扰[15]。内科胸腔镜手术操作简单、安全、损伤小、并发症少，可由呼吸内科医师独立完成，并可获得组织病理学诊断[10]；同时还可在内镜直视下探查整个胸膜腔，准确判断胸膜粘连程度，使组织病理诊断结果更加可靠。另外，有经验的医师能够直接根据镜下的胸膜表现判断是否为结核性胸膜炎，与病理检查结果高度符合[16]。但内科胸腔镜检查为有创性操作，且部分医院因条件有限不能实施而使胸腔镜诊断不足。故若能在未行胸腔镜检查前，通过临床实验室检测指标来判断是否存在胸膜粘连，对结核性胸膜炎治疗及预后判断有着重要的意义。

既往的研究提示，结核性胸膜炎胸膜增厚粘连主要与患者的年龄、病程及胸膜炎症的严重程度有关[17]，但缺乏早期预测胸膜增厚、粘连的客观指标的研究。既往研究已证实胸腔积液中检测到的ADA对诊断结核性胸腔积液有重要价值[18]。ADA在T淋巴细胞中含量最高，其活性水平与T淋巴细胞的数量及活性相关，可间接反映局部细胞的免疫状态。结核病是由T淋巴细胞介导的细胞免疫应答，故ADA活性在结核性渗出液中可升高。有研究表明，在结核病高发地区，测量胸膜结核的ADA是廉价、微创、快速的试验，对于疑似胸膜结核的患者，ADA检测是其他诊断工具的首选筛查方法[19-20]。2008年一项Meta分析的数据显示，ADA诊断结核性胸膜炎的敏感度和特异度分别高达92%和90%[21]，但ADA水平是否与胸膜粘连的严重程度密切相关暂无研究报道。本研究结果提示，胸膜粘连组患者胸腔积液中ADA水平明显高于无胸膜粘连组，差异有统计学意义；粘连组ADA的cut-off值为62.85 U/L时，是区别结核性胸膜炎粘连与无粘连最佳的敏感度和特异度，提示ADA水平是结核性胸膜炎胸膜粘连的独立危险因素。但是否ADA值与胸膜粘连程度动态相关，还有待进一步临床证实。

有文献报道，胸腔积液中有核细胞≥500×106/L及LDH≥1000 IU/L均提示胸膜的炎症反应较重；且LDH≥1000 IU/L的胸腔积液性质多为脓性，是胸膜炎症反应、增厚的因素之一[22]。本研究结果显示，胸膜粘连组患者胸腔积液中LDH水平也明显高于无胸膜粘连组，提示胸腔积液中LDH水平增高与结核性胸膜炎局部严重炎症反应有关，且当LDH cut-off值超过393.50 U/L时需警惕胸膜粘连。存在胸膜粘连的结核性胸膜炎患者治疗难度大、疗程长，而胸腔积液ADA、LDH与胸膜粘连严重程度有关，故可根据ADA或LDH水平评估患者预后及疗效。

ELISPOT技术通过使用特异性抗原诱导免疫细胞分泌特异性IFN-γ水平检测外周血或胸腔积液中结核分枝杆菌，为结核感染提供新的特异性诊断方法，国外已广泛开展全血T细胞酶联免疫斑点试验(QuantiFERON-TB)、分离后的PBMC-T细胞酶联免疫斑点试验(T-SPOT.TB)用于结核感染的诊断[23]，目前使用最多的免疫学检测方法是结核分枝杆菌特异性IFN-γELISOPT技术(IGRA技术)[24]。但2015年安蕾等[25]分析了20份(1085例)全血和14份(727例)胸腔积液的检测结果，汇总二者的敏感度和特异度分别为77%和71%、72%和78%，提示无论是在全血还是胸腔积液中单独使用IGRA检测，对结核性胸膜炎的诊断价值均存在一定的局限性。但既往未见IGRA技术与结核性胸膜炎严重程度动态变化是否存在相关性的报道。本研究显示，胸膜粘连严重程度对结核免疫ELISPOT斑点数结果无影响。

在先前的临床诊治过程中，结核性胸膜炎胸腔积液患者根据胸腔积液吸收情况将治疗转归分为[26]：痊愈(胸腔积液完全吸收)、胸膜增厚(胸腔积液吸收，但胸膜增厚粘连)和包裹(胸腔积液未完全吸收，胸膜增厚粘连)。积极控制胸膜炎症、减少渗出、清除胸腔积液、促进胸腔积液吸收，以及减少或减轻胸膜增厚和并发症的发生是结核性胸膜炎的治疗目的。早期发现结核性胸膜炎胸膜粘连可能，尽早、规律、联合抗结核药物治疗可控制胸膜腔内炎症，减轻胸膜粘连。有研究报道，胸腔内注射尿激酶可直接激活纤维蛋白酶原转变为纤溶酶，达到溶解和裂解纤维蛋白及纤维分隔、清除胸膜粘连、降低胸腔积液的黏稠度，是保证胸腔积液引流通畅、预防胸膜增厚的可操作方法。

本次研究尚存在不足之处，既往有文献提示结核性渗出性胸膜炎发生胸膜粘连与性别、族别、年龄、发病后就诊时间、胸腔积液中细胞计数的多少、抽取胸腔积液与否，以及抽放胸腔积液次数等也有一定的关系[27]；但本次研究并未对这些因素深入研究，提醒临床医师仍应全面考虑这些因素的影响，提高警惕，尽早采取相应的干预措施。

综上所述，虽然内科胸腔镜下判断胸膜粘连程度直接且准确，但在条件有限、无法或因其他因素不能操作内科胸腔镜检查情况下，胸腔积液中ADA、LDH水平可早期提示胸膜粘连严重程度，临床应提高防范意识，采取相应的诊治措施预防及治疗胸膜粘连及胸膜增厚，以提高临床治愈率，改善患者生活质量。