酶联免疫吸附试验在诊断HIV感染并发结核病患者中的价值

余艳艳 谭云洪 陈振华 陈忠南 刘彬彬 王珏

结核病目前仍然是严重危害人类健康的全球公共卫生问题。WHO指出，2016年全球1040万例结核病感染者中10%的患者同时并发HIV感染；2016年全球130万例结核病死亡患者中有37.4万例并发HIV感染[1]。结核病是HIV感染者最常见的机会感染之一，是HIV感染者疾病进展的重要促进因素[2]。国外有研究报道[3],结核病是艾滋病患者(AIDS患者)(包括已接受抗病毒治疗的患者)死亡的重要因素。HIV感染并发结核病由于病情复杂，因此诊断更为困难[4]。因此，在HIV感染者中对结核病进行早期筛查与诊断尤为重要。而HIV感染并发结核病患者的临床症状不典型、影像学表现无特异性、实验室病原学检查阳性率低，从而导致诊断困难，延误病情[5]。酶联免疫吸附试验(enzyme linked immune sorbent assay，ELISA)作为γ干扰素释放试验(interferon gamma release assay，IGRA)的一种检测技术，在诊断结核病方面得到了越来越多的应用。因此，本研究通过对2015年1月至2018年9月湖南省胸科医院就诊的HIV感染并发结核病的患者采用包括ELISA在内的3种检测技术进行诊断性研究，以分析ELISA对HIV感染并发结核病的诊断价值。

资料和方法

一、研究对象

搜集2015年1月至2018年9月湖南省胸科医院临床就诊的肺部疾病患者，共4568例，用ELISA法检测血清HIV抗体阳性，并经湖南省疾病预防控制中心采用免疫印迹法确诊为阳性的患者114例。HIV感染者的诊断标准参照中华人民共和国卫生部颁布的《艾滋病和艾滋病病毒感染诊断标准(WS 293—2008)》[6]。114例HIV感染患者中，按照《WS 288—2008 肺结核诊断标准》[7]，且经过诊断性抗结核药物治疗，确诊为HIV感染并发结核病患者95例，确诊为HIV感染并发非结核性肺疾病患者19例。其中男100例(87.72%)，女14例(12.28%)；30岁以下年龄段10例(8.77%)，30～岁年龄段53例(46.49%)，50～岁年龄段47例(41.23%)，≥70岁年龄段4例(3.51%)。95例HIV感染并发结核病患者中包括5例继发性肺结核并发淋巴结结核，3例继发性肺结核并发结核性胸膜炎，7例继发性肺结核并发淋巴结结核，1例继发性肺结核并发肠结核，2例血行播散性肺结核，77例继发性肺结核。19例HIV感染并发非结核性肺疾病中包括6例支气管扩张，9例慢性阻塞性肺疾病(急性发作期)，1例非结核分枝杆菌(NTM)感染，3例肺部感染。

二、研究方法

(一)标本留取

用无菌肝素钠抗凝管抽取每例患者的新鲜静脉全血≥3 ml,进行ELISA检测；均收集每例患者的痰标本(每份样本≥3 ml)，同一份痰标本同时进行GeneXpert MTB/RIF(简称“GeneXpert”)和分枝杆菌BACTEC MGIT 960(简称“MGIT 960”)检测。

(二)检测方法

1.ELISA：采用海口维提瑷生物研究院研制的结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应试剂盒进行检测。无菌技术下使用肝素钠管采集的新鲜静脉全血≥3 ml，于室温储存和运输，16 h内进行样品刺激。编号反应管“样本号-N”(表示阴性对照管)，“样本号-P”(表示阳性对照管)，“样品号-T”(表示检测管)。分别加入相应的刺激剂(修饰后的培养滤液蛋白-10和早期分泌抗原靶-6)，吸取1 ml静脉全血加入相应编号的反应管中并孵育22～24 h，将血浆上清移入标记好的1.5 ml Ependorff管(EP管)中。按照该试剂盒的说明书进行操作，酶标仪读取450 nm处的光密度值(A值)。计算结果，得出(P-N)和(T-N)值。当N<0.5 IU/ml时，(T-N)/(P-N)≥0.60时判为阳性，否则为阴性。当N≥0.5 IU/ml，(T-N)/(P-N)≥0.85时判为阳性，否则为阴性(当P-N≥10 IU/ml 时，按P-N=10 IU/ml 计算)。

2.GeneXpert：按照GeneXpert操作说明书进行前处理。取1 ml痰标本加入管中，加入2倍痰体积的标本处理液，振荡20 s后，静置15 min，用专用吸管取2 ml处理后的标本液缓慢加入反应盒的加样孔内。开启GeneXpert仪和电脑，待自检通过后，将反应盒放入模块中，系统自动进行核酸提取、扩增，以及目标序列的检测和结果判断。

3. MGIT 960：按照《分枝杆菌分离培养标准化操作程序及质量保证手册》[8]进行操作。

三、仪器与试剂

ELISA试剂盒由海口维瑅瑷生物研究所提供。MGIT 960全自动分枝杆菌检测系统及配套试剂由美国BD公司生产。GeneXpert检测仪器和试剂盒均由美国Cepheid公司提供。

四、统计学处理

应用SPSS 20.0软件进行统计学分析，对阳性率、敏感度、特异度、阳性预测值与阴性预测值的比较进行χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、 阳性检出基本情况

95例临床诊断的HIV感染并发结核病患者中，GeneXpert检出阳性40例，阳性率为42.11%(40/95)；MGIT 960检测阳性者45例，阳性率为47.37%(45/95)； ELISA检测阳性者64例，其中不确定结果8例，阳性率67.37%(64/95)。ELISA检测的阳性率高于GeneXpert和MGIT 960检测，且差异有统计学意义(χ2=50.031，P=0.000)。19例HIV并发非结核性肺疾病患者中GeneXpert检测阳性者0例； MGIT 960检测阳性者0例； ELISA检测阳性者 3例。

二、 ELISA试验的诊断效能

以临床诊断结果为标准，GeneXpert检测的敏感度和特异度分别为42.11%和100.00%；MGIT 960检测的敏感度和特异度分别为47.37%和100.00%； ELISA检测的敏感度和特异度分别为73.56%和84.21%，见表1。

讨 论

IGRA原理为检测外周血单个核细胞或(和)全血在结核分枝杆菌特异性抗原刺激下释放γ-干扰素(IFN-γ)的水平，判断受检者是否感染结核。目前主要应用的检测方法为：酶联免疫斑点法(enzyme linked immunospot assay,ELISPOT)和ELISA[9]。IGRA目前主要在活动性结核病的辅助诊断、儿童MTB感染的排查和HIV感染等免疫抑制或免疫缺陷者MTB潜伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)诊断中应用[10]。本研究结果显示，ELISA检测在HIV感染并发结核病中诊断的阳性率高于GeneXpert和MGIT 960，且差异有统计学意义；以临床诊断结果为标准，ELISA检测的敏感度高于GeneXpert和MGIT 960。

表1 以临床诊断为标准3种检测技术诊断HIV感染并发结核病的效能

注ELISA试验中有8例HIV感染并发结核病者的结果不确定。敏感度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%；特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%；阳性预测值=真阳性例数/(真阳性例数+假阳性例数)×100%；阴性预测值=真阴性例数/(真阴性+假阴性例数)×100%

本研究中ELISA检测的特异度为84.21%，低于GeneXpert和 MGIT 960。原因可能为本研究以临床诊断结果为标准，有些患者为非结核分枝杆菌NTM和MTB的混合感染，但临床上患者结核病表现不明显；部分患者既往感染了MTB但为非活动性肺结核，本次是因为呼吸道其他疾病如支气管扩张、慢性阻塞性肺疾病(急性发作期)就诊；有些患者感染了与IGRA检测抗原相交叉的NTM,如海分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌等有关；湖南省是结核病高发地区，不少患者为LTBI的可能性较大[11-13]。以上这些原因使得部分HIV感染并发非结核性肺疾病患者出现ELISA试验阳性。有文献报道，IGRA试验检测效能受MTB感染流行情况等影响，在低风险人群中检测的特异度较好，但在有潜在MTB感染的高危人群中检测的特异度明显降低[14-16]。国外研究显示，结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)诊断HIV感染并发活动性结核病的敏感度和特异度分别为37.2%和88.7%[17]，并建议在免疫功能高度抑制的AIDS患者中不推荐T-SPOT.TB的诊断方法，敏感度低的原因可能与在晚期HIV感染的患者中CD4+T淋巴细胞数量减少及功能降低。然而T-SPOT.TB是否确实受CD4+T淋巴细胞数量及功能影响，目前尚有争议；Nahid等[18]的研究显示，在HIV感染并发结核病患者中，T-SPOT.TB检测的阳性率并不受CD4+T淋巴细胞计数的影响。这些研究说明，T-SPOT.TB具有一定辅助诊断价值，但阴性检测结果也不能完全排除结核病。有研究指出，ELISA和PPD试验均是检测患者细胞免疫反应，用MTB特异性抗原刺激患者T淋巴细胞，观察是否有特异性细胞免疫反应来间接判断是否感染MTB；因为正常人的CD4+T淋巴细胞约占总T淋巴细胞的65%，所以这两种检测方法均与CD4+T淋巴细胞计数和活性有关[19-20]。同时有文献指出，ELISA阴性可以排除未受到严重免疫抑制的HIV感染成人的活动性结核病[21]。

有学者研究表明，由于ELISA试验设置了空白对照管和阳性对照管，可以评价被检者的基础免疫状态和试验操作是否得当(阳性对照管)来排除受试者体内嗜异性抗体效应和非特异性的IFN-γ等影响(空白对照管)，从而提高了方法学的可靠性[22-24]。HIV感染人群中，LTBI潜伏性感染者仅1年中就有约10%的几率发展成活动性结核病，远超非HIV感染人群[25]。LTBI和活动性结核病是相互关联而非相互独立的，特别是在HIV感染者中，可能在相当短的时间内经历了LTBI、亚临床结核病到活动性结核病的病情转变[26]。因此，在HIV感染者中对LTBI者的早期检测手段至关重要。由于ELISA检测有着较高的敏感度和特异度，并且检测快捷，故对HIV感染并发结核病的辅助诊断有一定的意义。

本研究不足之处在于：ELISA试验中由于检测管淋巴细胞产生IFN-γ受被检者淋巴细胞数量、活力、体质量指数(BMI)、是否吸烟、高浓度C反应蛋白(C-reaction protein，CRP)等多种因素影响[27-28]，本研究未能深入分析这些因素对检测结果的具体影响，也不知8例不确定结果的具体原因。GeneXpert与 MGIT 960属于病原学检测方法，标本来源于痰液；ELISA属于免疫学检测方法，标本来源于血液。有研究显示[29],痰标本的性状与痰菌检查结果密切相关，以干酪痰和脓性痰阳性检出率较高，血性痰及泡沫样痰阳性率较低。痰标本的性状对GeneXpert和 MGIT 960检测结果有一定影响。不同的标本来源及标本性状对GeneXpert、MGIT 960与ELISA检测结果存在不同影响。目前临床上HIV感染并发结核病的病原学阳性检出率低，鉴于ELISA检测的高敏感度与特异度，故将其与GeneXpert及 MGIT 960进行比较，以临床诊断结果为标准评价ELISA的临床诊断价值。另外，由于本研究HIV感染并发非结核性肺疾病患者例数少，有待增大样本量进一步研究，以便正确评价ELISA检测技术在HIV感染并发结核病患者中的临床诊断价值。