交叉引物扩增技术在结核病诊断中的应用

林百丰 苏欣 张学志

结核病是长期危害人类健康的慢性传染病，是严重的公共卫生问题。据2017年WHO报告估算全球共有1040万例结核病新发患者，平均发病率为140/10万，而我国肺结核发病患者例数居世界第3位，仅次于印度和印度尼西亚[1]。在2016年全球登记的540万例新发和复发的肺结核患者中有57%有细菌学证据，其余患者是根据胸部影像检查和患者的症状等被确诊为肺结核。目前，我国的肺结核诊断多以胸部X线摄影为主，具有病原学依据的肺结核仅为31%，这与我国仍然使用传统的方法诊断传染性肺结核有关。由于传统的痰涂片显微镜检查法敏感度低；痰培养检查法虽敏感度高，但耗时较长。原有的结核病诊断方法已不能满足早诊断早治疗的需求，所以我国的科研工作者利用分子生物学和基因组学检测快的优点，研制出很多新型的结核病核酸诊断技术和方法。本研究使用的交叉引物扩增技术(crossing priming amplification，CPA)就是其中之一。笔者将CPA与传统痰涂片显微镜检查法和痰培养法进行效能分析，评价CPA在结核病诊断中的应用价值。

对象和方法

一、研究对象

采集2017年5月至2018年3月五常市结核病防治所门诊初诊疑似肺结核患者的痰标本，按照《WS 288—2008肺结核诊断标准》进行诊断[2]，最终纳入267例肺结核患者，64例非结核性肺疾病患者，男200例，女131例。

二、 试剂和方法

1. 方法：由门诊医生指导患者留取3份合格的痰标本(即时痰、夜间痰和晨起痰)，每份痰标本约3～5 ml，分别进行痰涂片、痰培养和CPA检测。痰涂片检查严格按照《痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》[3]的要求进行，痰培养检查按照《分枝杆菌分离培养标准化操作程序及质量保证手册》[4]的标准化操作执行。

痰涂片检查：采用萋-尼抗酸染色法。使用一端有磨砂面的无划痕的新玻片，经95%乙醇脱脂，干燥、清洁后用2B铅笔在磨砂面上注明实验序号及标本序号；在生物安全柜中，小心打开承载痰标本的容器，防止产生气溶胶或使标本外溢, 仔细观察标本，使用折断的竹签毛茬端，挑取痰标本中干酪样、脓样或可疑部分约0.05 ml，于玻片正面涂抹成10 mm×20 mm的卵圆形痰膜。痰膜朝上静置在生物安全柜中自然干燥后进行染色镜检。

痰培养检查：采用固体培养法。在生物安全柜内将约2 ml痰标本置于相应的前处理管中；使用吸管将与痰标本等体积4% NaOH加入前处理管中；旋紧处理管螺旋盖，将处理管在涡旋振荡器上涡旋振荡30 s左右,将前处理管置于生物安全柜试管架内，室温静置15 min,以无菌吸管吸取前处理后的痰标本，均匀接种至酸性罗氏培养基斜面上，每支培养基接种约0.1～0.15 ml，旋上培养管螺旋盖，不要太紧；将培养基放置在斜面放置架上，保持培养基斜面水平向上；置于恒温培养箱内，(36±1) ℃孵育；24 h后，拧紧培养管螺旋盖，直立放置，继续孵育。接种后第3天和第7天观察培养情况，此后每周观察1次，直至第8周末。

CPA 检测：痰液中加入2～3倍体积的4%NaOH溶液，消化处理15 min，取消化好的溶液1 ml，置于1.5 ml离心管中，离心半径为8.8 cm,13 000 r/min离心5 min，离心沉淀用无菌生理盐水洗涤(重复2次)；洗涤后的沉淀中加入40 μl DNA提取液，经95～100 ℃裂解10 min后，离心半径为8.8 cm,13 000 r/min离心5 min。离心后的上清液作为CPA恒温扩增的DNA模板。每支玻璃化试剂反应管中加入15 μl缓冲液，然后加入20 μl石蜡油(防止污染)，静置2～3 min，待充分溶解后；分别给每个反应管中加入4 μl DNA样本，4 μl标准阴性对照和4 μl标准阳性对照，置于(63±2) ℃ 恒温金属浴60 min。待反应结束后，取出反应管依照说明书进行操作，15 min后读取结果并记录试验结果[5]。结果判读：先观察检测线(T线)，如果T线出现红色，则判定为阳性，即当前样本中有结核分枝杆菌核酸检出；如果T线没有出现红色，而质控线(C线)出现红色，则判定为阴性，即当前样本中没有结核分枝杆菌核酸检出；如果T线和C线都没有出现红色，说明检测失败。

2．试剂：痰涂片染色剂和痰培养的酸性罗氏培养基均购自珠海贝索生物技术有限公司；培养使用的4% NaOH为本实验室配置；结核分枝杆菌核酸检测试剂盒(恒温扩增-试纸条法)及干式恒温金属浴为杭州优思达生物技术有限公司生产。

三、质量控制

痰涂片显微镜检查和痰培养检查：为了保证试验的质量，应严格按照《结核病实验室检验规程》[6]质量保证的要求执行。每批培养基都用H37Rv标准株做质量控制。CPA的质量控制严格按照《结核病实验室质量保证手册》[7]的要求执行。

四、 统计学处理

采用SPSS 17.0软件对数据进行统计学分析，计数资料采用“率(%)”表示，采用配对卡方检验,以P<0.05为差异有统计学意义。计算CPA的检测效能指标：敏感度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%；特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阴性例数)×100%[8]。

结 果

331例患者中痰涂片检测阳性66例，阴性265例；痰培养阳性136例，阴性195例；CPA检测阳性137例，阴性194例。以痰培养检查结果为标准，CPA检测的敏感度和特异度分别为98.94%(186/188)、92.31%(132/143)。以临床诊断为标准，痰涂片检查的敏感度和特异度分别为23.97%(64/267)、96.88%(62/64)；痰培养检查敏感度和特异度分别为 48.69%(130/267)、90.63%(58/64)；CPA检查的敏感度和特异度分别为 51.31%(137/267)、96.88%(62/64)，见表1。 分别对痰涂片与痰培养、痰涂片与CPA的敏感度进行了统计学分析，差异均有统计学意义(χ2=62.23，P<0.01；χ2=69.05，P<0.01)，痰培养与CPA的敏感度进行比较，差异无统计学意义(χ2=1.50，P=0.219)；分别对痰涂片与痰培养、痰涂片与CPA检测、痰培养与CPA检测的特异度进行了比较，差异均无统计学意义(χ2=1.50，P=0.219；χ2=0.50，P=1.000；χ2=1.50，P=0.219)。

讨 论

早期诊断和治疗对结核病的预防控制至关重要，我国现有的基层结核病实验室诊断结核病主要以传统痰涂片检查和痰培养检查为主。常规痰涂片检查方法简单、快速、特异度高、成本低廉，但敏感度低，每毫升标本中含量5000～10 000条菌以上才能检出。痰培养检查法是目前结核病诊断的“金标准”，敏感度高但耗费的时间较长，每周都需要观察培养结果，至少3～4周才能获得结果，操作需要严格控制标本前处理时间，对实验室人员的操作水平要求较高，培养出阳性菌株后需要进一步的菌种鉴定，才可确诊是否为结核分枝杆菌。

与目前广泛使用的荧光PCR技术相比较，CPA技术反应速度快，反应时间约1 h，使试剂盒可用于检验检疫、突发性传染病的检测与监控现场检测或医院的床边诊断，检测成本低：目前荧光光定量PCR仪价格昂贵，无法在很多中小医院普及。CPA技术只需要离心机和一台简单的恒温装置，如普通的水浴锅、金属浴，即可进行扩增。操作简单，对操作人员的技能要求不高，绝大多数人通过简单培训或自学都可掌握，为核酸检测试剂的广泛应用创造了条件。

表1 以临床诊断为标准比较3种检测方法对结核病的检测效能

注敏感度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%，特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%,阳性预测值=真阳性例数/(真阳性例数+假阳性例数)×100%,阴性预测值=真阴性例数/(真阴性例数+假阴性例数)×100%

本研究中CPA检测以痰培养检测结果为标准，其敏感度和特异度分别为98.94%和92.31%。国内有报道可疑肺结核患者应用CPA检测敏感度为85.71%，特异度为98.92%[5,9]。以培养法为参照CPA检测结核分枝杆菌的敏感度分别为89.7%、89.8%、83.72%，特异度分别为92.9%、87.4%、98.98%[10-12]。从以上的敏感度和特异度的比较可以看出本研究以痰培养为标准，CPA的敏感度均高于其他方法，而特异度基本与其他研究保持一致的水平。由于本次采集的是X线胸片异常患者的标本进行的研究，从而使检测的敏感度有了很大的提高。如果在扩大标本量，CPA检测的敏感度和特异度可能还会有所提高，检测的结果会更加的准确。

以临床诊断为标准，痰涂片、痰培养和CPA检测的敏感度分别为23.97%、48.69%和51.31%，可以看出CPA检测的敏感度较高，对于痰涂片检测阴性，而痰培养正在等待时，在短时间内确定排菌患者有非常大的意义，但其不能确定死菌与活菌；痰涂片、痰培养和CPA检测的特异度分别为96.88%、90.63%和96.88%，CPA检测的特异度与痰涂片检测的特异度相同，但略高于痰培养的特异度，而且CPA检测缩短了时间，从收集标本到检测出结果约需2 h，更符合我国结核病早发现、早诊断、早治疗的需求。

综上所述，CPA检测对实验室的生物安全和实验室人员的技术水平要求不高，大大缩短了检测时间，并且CPA的敏感度和特异度比较高，因此，很适合在县(区)级结核病实验室中推广和应用。