西瓜ClWRKY54基因的克隆、亚细胞定位及表达分析

欧阳梦真 朱磊 孙治强 李胜利 吴帼秀 李阳 何富豪 李严曼

摘 要：WRKY轉录因子是植物中所特有的一类转录因子，以基因家族形式存在，并在植物的生长发育和逆境响应等过程中发挥重要的作用。采用RT-PCR的方法从西瓜中分离得到一条西瓜ClWRKY54基因。序列分析表明，该基因开放阅读框全长1 428 bp，编码475个氨基酸。其编码蛋白分子量约为51.82 KD，等电点为6.17。该基因蛋白序列中包含2个WRKY保守结构域，锌指结构为C2H2型，属于典型的1类WRKY基因。进化树分析显示，该基因蛋白序列同葫芦科作物中的甜瓜、黄瓜、西葫芦等的WRKY26具有较高的同源性，处于同一分支上。亚细胞定位分析显示，该基因编码蛋白定位于细胞核中。对该基因进行荧光定量PCR分析研究其表达特性，结果显示该基因在西瓜根、茎、叶中均有表达，但是在叶片中表达量最高;H2O2可以诱导该基因的表达，而乙烯处理可以抑制该基因的表达，这说明该基因可能参与逆境下H2O2和乙烯所介导的信号途径。在模拟干旱下，该基因表达无变化，说明该基因同干旱胁迫抗性不相关。本研究的结果将为进一步的解析ClWRKY54的功能奠定基础。

关键词：西瓜;ClWRKY54;亚细胞定位;表达分析

Cloning， subcellular localization and expression analysis of ClWRKY54 in Citrullus lanatus

OUYANG Mengzhen， ZHU Lei， SUN Zhiqiang， LI Shengli， WU Guoxiu， LI Yang， HE Fuhao， LI Yanman

（College of Horticulture， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， Henan， China）

Abstract： The WRKY transcription factors， uniquely existing in plants in the form of gene family， play important roles in plant growth， development and stress responses. In this study， a WRKY transcription factor gene ClWRKY54 was isolated from watermelon （Citrullus lanatus） leaves using reverse transcription PCR. Sequence analysis showed that the full length of the open reading frame of this gene was 1 428 bp， encoding 475 amino acids. The molecular weight of the encoded protein was about 51.82 KD and the isoelectric point was 6.17. The protein sequence of the gene contained two conserved WRKY domains with a C2H2 type zinc finger structure， respectively， which was a typical feature of the WRKY Group 1. Evolutionary tree analysis showed that the protein sequence of the gene was highly homologous with WRKY26 of Cucurbitaceae crops such as melon， cucumber and zucchini. Subcellular localization analysis showed that the ClWRKY54 was located in the nucleus. The expression characteristics of the gene were analyzed by quantitative RT-PCR. Results showed that the gene was expressed in roots， stems and leaves of watermelon， but the highest expression was found in leaves. H2O2 could induced the expression of ClWRKY54， while ethylene treatment could inhibit its expression， indicating that the gene might participate in the signal pathways mediated by hydrogen peroxide and ethylene under stresses. Under drought， the expression of ClWRKY54 remained unchanged， suggesting that it might not be related to drought stress. The results of this study would lay a foundation for further analysis of the functions of ClWRKY54.

Key words： Citrullus lanatus; ClWRKY54; Subcellular localization; Expression analysis

植物在生长过程中会遭受到各种类型的生物和非生物胁迫。为了抵御环境胁迫，植物在长期的进化过程中形成了一系列复杂的保护机制。通过这种机制，植物迅速感受和传递逆境信号，然后激活一系列抗性基因来提高自身对逆境的抵御能力。近年来，基因组测序工作的完成极大方便了人们对逆境胁迫相关基因的研究。目前已经有许多与逆境相关的基因被分离出来，尤其是WRKY、NAC、MYB、ERF等各种转录因子。对这些基因功能的解析将有助于我们揭示植物响应逆境的各种调控网络。

WRKY转录因子是植物所特有的一类转录因子，以基因家族形式存在。目前WRKY转录因子的基因已经陆续在不同作物中被分离和鉴定出来，包括葡萄、番茄、水稻、黄瓜等[1-4]。在不同的植物中WRKY家族所包含的基因数目不一样，例如番茄中包含81个WRKY转录因子[2]，而水稻含有100多个[5]，在西瓜中分离到了57个WRKY转录因子基因[6]。所有的WRKY转录因子基因蛋白序列中包含1个或2个有60个氨基酸的WRKY结构域，其C端含有C2H2或者C2HC类型的锌指结构[7]。许多研究表明，WRKY转录因子家族基因在植物对逆境的响应过程中发挥重要作用。研究发现，过量表达黄瓜CsWRKY46的拟南芥植株同对照相比，其耐低温能力得到了显著提高，同时其能通过ABA信号途径来调控植物的耐低温性[8]。棉花中的研究发现，GhWRKY3可以被各种逆境信号分子（SA、MeJA、ABA、GAs 和ET）、机械损伤以及病原菌侵染等所诱导表达，而6-BA、生长素、干旱、NaCl和低温（4 ℃）处理对其表达却没有影响[9]。过表达菊花DgWRKY1的烟草植株表现出较强的耐盐性[10]。PEG、NaCl、低温和H2O2均可以诱导水稻中的TaWRKY10基因表达，其在烟草中的过量表达可以提高烟草的耐盐和耐旱性[11]。这些研究说明，WRKY家族基因可能在多种逆境中发挥重要的调控作用，同时可能参与多种逆境信号途径。

西瓜（Citrullus lanatus），属于葫芦科西瓜属，一年生蔓生藤本。由于营养丰富和美味，广受世界各地消费者的喜爱，而我国是世界上西瓜种植面积最大的国家。西瓜在生长过程中容易受到各种逆境的影响，极大影响其产量和品质，因此对于西瓜抗逆性的研究具有重要的经济价值。前期研究中，根据西瓜基因组测序信息，已经将西瓜中所有的WRKY基因序列下载下来，对所有WRKY家族基因进行鉴定、分类和命名，并系统分析了所有西瓜WRKY家族基因对低温的响应情况[6]。笔者以西瓜叶片为材料，利用RT-PCR将ClWRKY54克隆出来，通过构建GFP和ClWRKY54的融合表达载体，转化烟草对该基因编码蛋白进行亚细胞定位分析，采用荧光定量PCR（qRT-PCR）的方法研究该基因在不同组织中的表达情况，以及在逆境胁迫和信号分子作用下，该基因在西瓜叶片中的响应特点，可以为下一步通过转基因的方法揭示ClWRKY54在西瓜逆境调控中的作用机制奠定一定的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

西瓜材料‘砧木西瓜（ZXG01016）种子由中国农业科学院郑州果树研究所提供。2018年5月于河南农业大学园艺学院人工气候室进行育苗。

1.2 方法

1.2.1 西瓜ClWRKY54基因的CDS克隆 采用北京华越洋生物的快速通用植物RNA提取试剂盒3.0提取西瓜叶片总RNA，然后采用ABM公司的5X All-In-One RT MasterMix （with AccuRT Genomic DNA Removal Kit）试剂盒将RNA反转录cDNA。根据前期从西瓜数据库中下载的ClWRKY54基因（Gene ID：Cla018026）序列設计特异性引物（ClWRKY54-CDS-F：5′-ATGAATAACATAAATCAAACGA-3′;ClWRKY54-CDS-F-R：5′-CTAA

GATAGAAATGAGTTGATGAA-3′）。以西瓜叶片cDNA为模板进行反转录PCR扩增，将ClWRKY54基因的CDS区域克隆出来。PCR反应体系为25 ?L，Prime STAR MAX Premix（2×）12.5 ?L，模板cDNA 1 ?L，上下游引物各1 ?L，dd H2O 9.5 ?L，总体积为25 ?L。PCR扩增程序为94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，35个循环;72 ℃ 10 min，4 ℃保存。

1.2.2 西瓜ClWRKY54基因的生物信息学分析 通过ExPASy软件（https：//web.expasy.org/cgi-bin/protparam/Protparam）进行蛋白质分子量和等电点的预测。利用在线软件Plant-PLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）预测其编码蛋白的亚细胞位置。通过 MEGA 6.0软件进行不同序列的进化树分析，采用的方法是Neighbor-joining。通过Clustalx 2对不同序列进行多重比对分析。

1.2.3 西瓜ClWRKY54基因编码蛋白的亚细胞定位 亚细胞定位所用的载体为pH7LIC5.0-ccdB rc-N-eGFP载体。首选将GFP载体进行Stu I酶切，获得线性化片段。通过ClWRKY54特异引物和高保真酶Prime STAR MAX进行扩增获得ClWRKY54基因的CDS序列，并送样测序。选取测序正确的菌液为模板，在ClWRKY54特异引物的前端加上15个GFP载体同源序列（wrky54-GFP-F：TACGCCGAGGCCTGCATGAATAACATAAATCAAAC;wrky54-GFP-R：TTAGGGAAGAGGCCTCTAAGATAGAAATGAGTTGATGA），然后采用高保真酶进行PCR扩增，获得带有Stu I酶切位点的ClWRKY54序列。将获得的载体线性化片段和带有Stu I酶切位点的ClWRKY54基因的PCR产物，进行纯化回收。按照摩尔比1︰2的比例，并利用In-Fusion的同源重组技术进行连接反应，转化DH5a菌株，扩繁和检测阳性克隆。最后提取质粒，并进行检测。将GFP和ClWRKY54重组载体转入农杆菌GV3101后，于28 ℃ YEB培养基中揺培，离心后用农杆菌渗透液重悬菌体，最终使OD600值达到0.8，25 ℃黑暗放置2～3 h。选取长势良好的本氏烟植株，将上述菌体悬浮液用2.5 mL的一次性注射器吸取出来，从烟草叶片下表皮慢慢注射，让菌液充满整个烟草叶片，黑暗培养2 d后使用激光共聚焦显微镜观察烟草叶片中绿色荧光蛋白的表达情况。

1.2.4 ClWRKY54基因荧光定量PCR分析 西瓜幼苗长至2叶1心时，选取生长一致的西瓜，分别进行模拟干旱和信号（乙烯和H2O2）分子处理。干旱处理为将苗的根部浸入400 mmol·L-1的甘露醇溶液中。乙烯和H2O2处理分别为对西瓜全株喷洒浓度为5 mmol·L-1的乙烯和10 mmol·L-1的H2O2溶液。在0、6、12、24和48 h分别采集各处理下的叶片样品。将清水处理的西瓜幼苗叶片设置为对照。为了分析ClWRKY54基因的组织表达特性，分别采集2叶1心时期西瓜根、茎、叶的部分组织。采集的样品用液氮速冻，-80 ℃冰箱备用。每个处理设 3 次重复，每次重复3株幼苗。

采用北京华越洋生物的快速通用植物RNA提取试剂盒3提取西瓜叶片的总RNA，然后采用Takara公司PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）试剂盒将RNA反转录成cDNA。以elongation factor 1-a作为内参基因[12]。ClWRKY54荧光定量PCR引物为ClWRKY54-F：CATCGGTA

GTCATTCTTTCC;ClWRKY54-R：TATGTCATCTCTGGCTTCTT。采用ABM公司EvaGreen 2X qPCR MasterMix荧光定量试剂盒，在Applied Biosystems StepOne and StepOnePlus Real-Time PCR Systems（ABI，美国）进行荧光定量PCR反应。荧光定量采用20 ?L PCR反应体系：cDNA模板2 ?L，Forward primer 1 ?L，Reverse primer 1 ?L，Premix TaqTM 10 ?L，ddH2O 6 ?L。反应程序为95 ℃，30 s;95 ℃，30 s;60 ℃，20 s;72 ℃，延伸30 s;40个循环。荧光定量试验结果最后采用2?ΔΔCT的方法进行计算[13]。具体计算过程如下：用目的基因Ct值减去自身内参基因Ct值，得到的数就是ΔCt;用所有样本的ΔCt减去对照组样本的ΔCt，得到ΔΔCt;对所有ΔΔCt结果前面加上负号即取负数，得到的结果就是-ΔΔCt。最后，对-ΔΔCt进行2的幂运算，即2-ΔΔCt。

2 结果与分析

2.1 西瓜ClWRKY54基因的CDS克隆

前期研究中，笔者已经根据西瓜基因组测序信息下载下来西瓜WRKY基因家族所有基因序列，并根据染色体分布位置将57个家族基因分别进行命名，根据其中的ClWRKY54序列设计特异性引物，以西瓜叶片cDNA为模板进行RT-PCR扩增，得到西瓜ClWRKY54基因的ORF全长序列（图1）。其ORF全长1 428 bp，编码475个氨基酸。通过软件进行预测，发现其编码蛋白分子质量约为51.82 kD，等电点为6.17。将ClWRKY54在NCBI上进行Blastx比对，发现与其他物种的WRKY26和WRKY33具有较高的相似性。与甜瓜（Cucumis melo）、黄瓜（Cucumis sativus）、西葫芦（Cucurbita pepo subsp. pepo）等的WRKY26相似性达到86%以上。

2.2 西瓜ClWRKY54的同源性分析

将ClWRKY54蛋白序列与在NCBI上与其相似性相对较高的WRKY基因编码的蛋白质序列进行多序列比对（图2）。结果发现，这些蛋白均具有WRKY基因家族中第1类WRKY转录因子的典型特征，序列中均含有2个WRKY蛋白结构域，其锌指结构类型均为C2H2类型。同时不同物种WRKY蛋白序列在N和C末端相对来说保守性较差，而在WRKY结构域保守性却非常高。

将其他物种中与ClWRKY54相似性较高的18个蛋白序列下载下来，将ClWRKY54蛋白序列与这18个基因编码的氨基酸序列一起进行进化分析，构建系统进化树（图3）。进化树分析表明，所有序列明显分为2个大类，其中所有的WRKY33和辣椒的CaWRKY26位于一个大的分支上，而西瓜ClWRKY54与苦瓜McWRKY26、甜瓜CmWRKY26、黄瓜CsWRKY26、南瓜CmWRKY26位于另一个分支上，这些同属于葫芦科植物，说明ClWRKY54同这些基因的氨基酸序列具有较近的亲缘关系，同时说明ClWRKY54可能同这些基因具有相似的功能。

2.3 西瓜ClWRKY54的亚细胞定位分析

首先通过Plant-PLoc軟件预测了ClWRKY54编码蛋白的亚细胞位置，结果定位于细胞核中。为了验证预测的结果，构建35S：ClWRKY54-GFP的融合表达载体，注射到烟草下表皮细胞中，在激光共聚焦显微镜上观察绿色荧光蛋白在细胞中的位置，发现重组质粒侵染的细胞，只有在细胞核上可以观测到荧光信号。这说明ClWRKY54是一个核定位蛋白，这与其作为转录因子的功能特点相符（图4）。

2.4 西瓜ClWRKY54的表达分析

由图5可以看出，西瓜ClWRKY54在干旱条件下表达量同对照相比没有显著差异。植物信号分子在植物对逆境的响应过程中参与复杂的调控网络，为了研究ClWRKY54可能参与的信号途径，分析了该基因在乙烯和H2O2处理下的表达情况，结果表明，H2O2早期可以显著诱导ClWRKY54基因表达，而乙烯可以显著抑制ClWRKY54基因表达。对ClWRKY54基因进行组织表达分析发现，ClWRKY54在西瓜不同组织中均有表达，在叶片中表达量最高，其次是茎和根。

3 讨论与结论

WRKY转录因子是植物所特有的一类转录因子，WRKY转录因子家族也是包含基因最多的转录因子家族之一。其家族基因不仅在植物的生长发育过程中发挥着重要作用，同时也参与植物对各种逆境的抗性反应过程[14-16]。目前关于WRKY转录因子的功能也是研究的热点，在许多植物中的生物学功能已经得到了广泛的研究和阐述，而关于西瓜WRKY基因家族基因功能的研究相对较少。西瓜是我国重要的经济作物，其产量和品质在生产中常常受到各种环境因子的影响。前期研究中，笔者对西瓜的WRKY家族基因进行了鉴定、分类、命名及低温表达分析，其中ClWRKY54是一条对低温响应较为敏感的基因[6]，因此在本研究中对西瓜ClWRKY54的生物学功能进行重点研究。

對蛋白质序列进行分析发现，ClWRKY54具有典型的WRKY家族结构特征，包含2个WRKY结构域，属于WRKY家族I家族的成员。进化树分析显示，ClWRKY54同葫芦科作物植物中的苦瓜McWRKY26、甜瓜CmWRKY26、黄瓜CsWRKY26、南瓜CmWRKY26表现出较高的相似性，这说明ClWRKY54可能与这些基因具有相似的功能。笔者首先通过Plant-PLoc软件预测了ClWRKY54蛋白的亚细胞位置，结果显示其可能位于细胞核中。为了进一步验证预测结果，通过GFP荧光定位方法对其进行亚细胞定位，结果发现其位于细胞核中。这与许多前人研究结果一致[8，10]。作为一种转录调节因子，WRKY可能是通过与其他基因的启动子区域进行结合而调节其他基因的表达。

虽然很多研究表明WRKY广泛参与植物对逆境的抗性反应，同时调节植物的生长发育过程。但是WRKY家族中每个基因功能各异。因此，为了进一步研究其功能，笔者采用荧光定量PCR分析了ClWRKY54基因的表达特性，实时荧光定量PCR结果表明，在干旱条件下，ClWRKY54基因表达无显著变化，表明ClWRKY54可能不参与植物对干旱胁迫的抗性。同时许多研究发现，WRKY受各种信号分子的诱导，参与植物对逆境响应的各种信号途径[9]。活性氧（ROS）可以影响许多基因的表达，进而影响植物对逆境的响应，而H2O2是其中一个关键的信号分子[17-18]。乙烯是一种重要的逆境响应信号分子，可以调控植物对逆境的抗性反应[19]。棉花中的研究发现，乙烯和H2O2均可以诱导GhWRKY3基因的表达[9]，葡萄的乙烯响应转录因子VaERF092可以通过结合到VaWRKY33启动子区域从而调控其表达，进而提高植物的抗冷性[20]。水稻中的研究发现，TaWRKY51转录因子可以通过负调控乙烯的生物合成进而影响侧根的形成[21]。因此，本研究中笔者分析了其对H2O2和乙烯的响应情况，结果发现，H2O2在早期可以诱导其表达，说明其可能参与H2O2所有诱导的信号途径。乙烯处理却可以显著抑制ClWRKY54表达，这表明ClWRKY54基因可能同乙烯信号途径存在负调控关系，具体功能还需进一步的研究确定。对ClWRKY54基因进行组织表达分析发现，其在根、茎、叶中均有表达，在叶片中的表达量最高，而在根中的表达量最低，说明该基因在不同组织中的表达具有差异，这与在其他植物中的研究结果相一致[8，22]，同时说明该基因的功能可能涉及到多个方面。

综上所述，笔者从西瓜叶片克隆到西瓜的ClWRKY54基因，其蛋白序列中包含2个WRKY结构域，同时其锌指结构类型均为C2H2，属于WRKY基因家族中1类家族的典型特征。该基因编码蛋白定位于细胞核中。基因表达分析显示，该基因在根、茎、叶中均有表达，在叶中表达量最高。该基因表达受乙烯抑制，受H2O2诱导，ClWRKY54可能参与多种逆境信号途径，干旱模拟对其表达无影响。

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