地中海贫血基因检测试剂质量管理规范核查关注点

陈静 魏增江 林卓立 广东省药品监督管理局审评认证中心 （广东 广州 510080）

内容提要： 地中海贫血是我国长江以南各省高发遗传病之一，基因检测是诊断金标准，文章从地中海基因检测试剂质量管理规范核查的角度进行研究，旨在为现场检查和审评提供参考，把控产品的安全性和有效性。

根据《6840体外诊断试剂分类子目录（2013版）》[4]，地中海贫血基因检测试剂属于三类体外诊断试剂的范畴。根据《体外诊断试剂注册管理办法》的规定，境内第二类、第三类医疗器械注册质量管理体系核查，由省、自治区、直辖市食品药品监督管理部门开展[5]。截止2019年2月，经国家药品监督管理局网站查询，广东省地中海贫血基因检测试剂有效期内注册证超过全国注册证60%，广东省对地贫基因检测试剂质量管理规范核查具有丰富经验，本文就地贫基因检测试剂质量管理规范核查的主要问题和重点关注事项进行阐述，旨在为现场检查和审评提供参考，规范行业发展，确保产品的安全性、有效性、可靠性[6,7]。

1.主要原材料

地中海贫血基因检测试剂的主要原材料包含引物、探针、酶、dNTP、参考品等。具体如下。

1.1 引物和探针

着重关注引物和探针的设计原则，引物、探针核酸序列、模板核酸序列及二者的对应情况。质量标准至少包括纯度检查、功能性试验等。如为外购，应包含合成产物的质检证明。如带有荧光标记物的探针，应明确标记的荧光基团。

1.2 酶

地中海贫血基因检测试剂主要包括DNA聚合酶，其质量标准包括DNA聚合酶活性、热启动能力、热稳定性，是否具有内切或外切酶活性。如其他工具酶，应包含质检证明和验证资料。

1.3 脱氧三磷酸核苷（dNTP）

包含dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP；质量标准应至少包括纯度检查及（或）功能性实验等。

1.4 产品研制所用参考品

参考品是产品性能溯源的根源，应关注如下内容：①阳性参考品：包括全部缺失/突变类型。临床常见突变/缺失基因位点的阳性参考品可使用含人类基因组的临床样本或其核酸提取液，临床少见的缺失/突变基因位点可使用细胞系或质粒样品。②阴性参考品：使用经鉴定无相应靶突变序列的质粒样品、含人类基因组的临床样本或其核酸提取液。③检测限参考品：参考阳性参考品，需包含所有的突变类型。④重复性参考品：使用临床常见缺失/突变基因位点的质粒、细胞系、临床样本核酸提取液等。

2.主要生产工艺及反应体系

2.1 主要生产工艺

地中海贫血基因检测试剂类产品的生产工艺主要包括PCR反应液制备、质控品制备、膜条和/或显色相关配套试剂制备等，关键工序应准确识别，评价关键工艺参数需设置过程控制点。

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2.2 反应体系重点关注

样本用量、采集和处理方式等；引物/探针、酶、dNTP、缓冲离子的浓度和用量等；扩增程序的确定；温度、时间等关键参数的确认。

3.性能评估

地贫基因检测试剂的性能评估主要包括：准确性、特异性、检测限、重复性、核酸提取效率等。性能指标和检验方法应符合YY/T 1527-2017《α/β-地中海贫血基因分型检测试剂盒》的要求。

4.临床试验

临床试验符合《体外诊断试剂注册管理办法》[5]和《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》[8]等法规的要求。

4.1 试验机构

临床试验选择至少3家（含3家）国家药品监督管理局医疗器械临床试验备案的临床机构，同时出具医学伦理委员会意见[9]。根据地中海贫血具有地域性的特性，应综合不同地区、民族等人群差异，以及流行病学背景，选择具有一定地域代表性的试验机构和受试者。

4.2 试验方法

地贫基因检测试剂的临床试验所选对比试剂在预期用途、适用人群、样本类型等方面应与申报产品具有较好的可比性。性能指标不低于对比产品。对检测结果不相符的样本，应选择合适的方法（如第三方试剂、临床普遍认为灵敏度和特异性较好的核酸序列测定方法等）进行确证。

4.3 受试对象

明确纳入/排除标准、样本剔除标准等。例如，受试人群应尽可能包含预期用途所声称的所有适用人群，不同区域、不同年龄段以及不同性别的受试者应尽量均匀分布。

4.4 样本量

临床试验样本量至少1000例。地中海贫血基因检测试剂临床试验的样本量与多种因素相关，如检测的可重复性、干扰因素、亚组间的差异性、地贫基因类型的人群携带率等，需结合产品的具体情况进行临床验证，如有需要，建议细化各种亚组别/类型样本的例数要求。

4.5 临床评价指标及统计学分析

地贫基因检测试剂一般为定性检测，其临床评价指标一般涉及：阳性符合率、阴性符合率、总符合率等。建议使用四格表卡方或kappa检验进行一致性分析。

5.采购环节

采购环节关注主要原材料的采购，具有制定供应商管理制度。包括与供应商签订质量协议；建立供应商审核制度。主要原材料按批次进行进货查验，记录完整并确保整个过程具有可追溯性。

6.生产管理环节

人员：具备相关专业知识、工作技能，经过培训并通过考核。

设备/器具：设备/器具应在验证/校准合格期内，且与生产批量匹配，精准度应满足要求，并在生产一定周期后进行再确认。生产过程中使用的移液器应与生产批量相适应，首选量程相近的微量移液器。

物料：生产时所使用的原材料应与设计开发输出的原材料要求一致，且经过验收/检验。生产过程中主要原辅料应物料平衡。

生产环境：地中海基因检测试剂的生产和检验应当在独立空间内进行，防止扩增时的气溶胶造成交叉污染。其配制、分装、点膜、干燥、切割以及内包装等生产区域满足相应的洁净度级别[7]。

生产工艺：根据设计开发输出的生产工艺规程进行生产，对于生产过程的关键控制点进行监控。

标识：生产过程中应对设备、产品及其检验状态作出标识。

追溯：生产过程中持续保持相关记录并符合可追溯性要求。

7.质量控制环节

检验要求：菌种的来源、验收、储存、保管、使用、销毁，应执行国家有关规定，菌种传代应有记录，并具有可追溯性。

追溯：应有批检验记录，并满足可追溯要求。

不合格品控制：建立不合格品控制程序。

留样：应根据产品和工艺特点制定留样制度。

放行：应按产品放行审核程序的要求对产品进行放行管理。

8.小结

基因诊断对于地贫确诊是必须的，是高风险胎儿产前诊断的有效手段。为了保障地贫基因检测试剂的安全性，有效性，本文从地贫基因检测试剂质量管理规范核查的角度出发，规范行业发展，也为检查和审评提供参考。