高效液相色谱/飞行时间质谱联用技术在药学研究中的应用

杜光光，王佳，李婷，刘继华

（吉林大学药学院，长春 130021）

高效液相色谱/飞行时间质谱联用（HPLC/QTOFMS）是一种结合了超高效液相的高分离能力和四级杆飞行时间质谱的高分辨及功能的新型技术，它不仅可以对化合物进行结构鉴定，且其在全扫描范围内都具有很高的灵敏度，为微量成分的快速鉴定提供了强有力的技术手段。目前，已广泛应用于药学、化学等各个领域的研究，使化合物结构分析工作进入新时代，推动了科学的进步。本文主要综述了超高效液相色谱/飞行时间质谱联用技术在药学研究中有关药物结构鉴定、药物代谢及生物大分子研究方面的应用。

1 在药物结构鉴定中的应用

药物结构总的来说包括药物有效成分的结构、药物中杂质的结构，超高效液相色谱/飞行时间质谱联用技术与其他的分析方法相比，具有效率高、速度快、操作简单等优点，在药物结构鉴定中具有重要意义。

1.1 在中药活性成分鉴别中的应用

在检测样品量少的情况下，用高效液相色谱-质谱联用仪器结合四级杆飞行时间检测器检测技术，比较样品和标准化合物的保留时间，紫外吸收光谱和质谱中的分子离子峰和具有特征性的碎片峰来鉴别药物活性成分结构。韩彦琪等[1]利用超高效液相色谱-四级杆/飞行时间质谱（UPLC-Q/TOF）技术分析出了玫瑰花抗炎症的活性成分为食子酸、4-O-没食子酰基奎宁酸、没食子酸甲酯等7种有效活性成分，为玫瑰花抗炎作用的阐述和抗炎机制研究提供了参考。卞振华等[2]利用UPLC-QTOF-MS/MS技术分析五味子的体外抑菌活性组分，根据一级质谱提供的相对分子质量和二级质谱高能量碰撞碎片信息，初步鉴定了11个化合物，分别为奎尼酸、苹果酸、柠檬酸、苹果酸异构体、咖啡酰奎尼酸、莽草酸、柠檬酸单甲酯、原儿茶酸、富马酸单乙酯、2-羟基-丙基三羧酸-2-乙酯和柠檬酸二甲酯；该试验初步筛选了五味子抑菌活性部位，为开发天然抑菌制剂提供了方法和思路。赖丽嫦等[3]通过高效液相色谱串联-四极杆飞行时间质谱法（HPLC-Q-TOF-MS）鉴定广金钱草中主要活性成分41种，其中包括37个黄酮类成分、4个酚酸类成分；通过HPLC-Q-TOF-MS联用技术，为阐明广金钱草药效物质基础提供参考。施树云等[4]建立DPPH-HPLC-QTOF-MS/MS方法快速筛选、鉴定和检测杜仲黑茶中抗氧化活性成分，确定抗氧化活性成分为没食子酸、新绿原酸、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、表没食子儿茶素没食子酸酯、槲皮素-3-O-桑布双糖苷、芦丁和异槲皮苷，所建立的方法无须繁琐的分离纯化过程，可快速、灵敏、准确、高通量筛选复杂体系中的抗氧化活性成分，并为杜仲黑茶的质量控制提供科学依据。

有的药物中含有的有效成分不是单一组分，而是由多种化合物共同组成的，在这种情况下清楚地知道每一种化合物的结构和理化性质对研究该药物的药效学和药动学尤为重要。宋玉梅等[5]建立了超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UHPLC-Q-TOF-MS）测定银黄颗粒中活性成分的定性和定量分析方法，结果发现，对其中14个化合物得到了鉴定，12个化合物通过与对照品比较，保留时间、精确分子量和多级质谱信息得到了结构确证，可见此分析方法可有效用于银黄颗粒的质量评价与控制。刁义平[6]采用超高效液相色谱-电喷雾质谱法对复方紫灵胶囊中化学成分进行分析，共鉴定出30个化合物，该方法对复方紫灵胶囊的成分鉴定提供了一种快速准确的分析方法。

王辉俊等[7]采用UPLC/ESI-QTOF-MS法鉴定瓜蒌皮注射液中化学成分，结果发现，在正负离子模式下，共鉴别出瓜蒌皮注射液化学成分19个，包括7个氨基酸、4个核苷酸、5个黄酮、1个多肽、1个唾液酸和1个含氮化合物，此分析方法为阐明瓜蒌皮注射液的化学物质基础提供依据。游飞祥等[8]运用高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用技术（HPLC-Q-TOF/MS）对六经头痛片中的化学成分进行分析鉴定，通过质谱裂解规律结合自建的8味组方药材的化学成分库信息，共鉴定出95个化合物，主要包括异黄酮类、香豆素类、环烯醚萜类和苯酞类等成分，并对化合物的药材来源进行了归属，采用HPLC-Q-TOF/MS联用技术比较全面地阐明了六经头痛片的化学组成，为其药效物质基础研究和质量控制提供了参考。束艳等[9]采用液质联用技术（LC-MS）对中药柔肝胶囊（丹参、姜黄等）中的化学成分进行定性分析，结果表明，通过Q-TOF/MS正、负离子质谱信息及元素组成分析并结合对照品与相关文献数据对照，共鉴定出19个化合物，主要结构类型为水溶性酚酸类、姜黄素类、皂苷类及异黄酮类化合物。李颖等[10]通过超高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱法技术定性分析水飞蓟素胶囊中的化学成分，然后结合参考文献和对照品信息，共鉴定化合物15个，包括二氢黄酮化合物1个、黄酮醇化合物2个、二氢黄酮醇化合物3个、黄酮木脂素类9个，此分析方法对水飞蓟素胶囊的成分进行定性分析，为其质量控制及药效机制的阐明提供科学依据。

1.2 在复杂成分筛选中的应用

在所服用的药物中，大多数药物的化学成分、作用机制、代谢途径都被研究得很清楚，但也有一些成分复杂的药物对它的成分组成、起效机制、活性成分和代谢途径了解得不够透彻，这就严重阻碍了此类药物的发展，所以，找到一种合理的分析方法去分析这种药物显得尤为重要，而UPLC/QTOF-MS联用分析技术就以其特有优点在药物复杂成分筛选方面被广泛应用。Bringmann等[11]采用HPLC/QTOF-MS分析技术检测了热带葛藤类植物提取物的化学组成成分，通过分析发现了2个新的天然产物，并确证其结构和构型。Wolfender等[12]采用UPLC/QTOF-MS技术检验了龙胆科、豆科的多种植物，结果表明，在样品很微量的情况下也能快速且准确地对具有生物活性的化合物进行分离与鉴别，用此方法分析萝摩科三酚丹主要活性成分为菲吲哚里西丁类生物碱；首先分离得到3种骨架10个菲吲哚里西丁类生物碱，在此基础上用HPLC-MS技术对有效部位进行了考察，分析检测到11个微量的菲吲哚里西丁类生物碱成分，通过参照单体化合物的质谱裂解规律，分析推测了一些微量成分的化学结构。郑伟等[13]采用UPLC/QTOF-MS技术分离和鉴定知母粗提物中的甾体皂苷，在正、负极MSE扫描模式下，最终鉴定出了67个甾体皂苷，包括16个同分异构体、14个新甾体皂苷化合物。

1.3 在药物杂质分析中的应用

高效液相色谱/飞行时间质谱连用技术是药物杂质分析中的常用技术之一，HPLC/QTOF-MS技术可以随时检测药物合成过程中的中间体、副产物或降解产物，具有卓越的灵敏度、高选择性和快速的特点，已经成为药物中杂质分析和结构鉴定的首选。杨伟峰等[14]利用高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法对奥替拉西钾中主要杂质进行结构推定，并且分析其来源，结果表明，通过对奥替拉西钾及其主要杂质的一级与二级高分辨质谱图进行分析，推定主要杂质的分子结构为1,3,5-三嗪-2,4-（1氢,3氢）-二酮和2-（3-氨基甲酰脲基）-2-羰基乙酸，2个主要杂质均由奥替拉西钾降解得到。潘芳芳等[15]采用高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱法分析头孢拉定中主要杂质并对其结构进行鉴定，通过四极杆-飞行时间二级质谱图特征碎片的分析确定了头孢拉定中1.32%的未知杂质为双氢头孢拉定，同时推测该杂质可能是中间体双氢苯甘氨酸中的杂质（四氢苯甘氨酸）参与合成引进的；该方法鉴定了头孢拉定中的1个未知杂质，进而可以对药品杂质控制和工艺优化提供参数。朱培曦等[16]利用液质联用技术对尼群地平原料药中的2个杂质进行在线的质谱分析，直接推断出了2个杂质可能的化学结构，检测结果对于尼群地平原料药的杂质分析、质量控制和合成工艺的改进具有重要作用。候晓蓉等[17]利用高效液相色谱-质谱联用技术对醋氯芬酸中的主要杂质进行鉴别，检测出其主要杂质为双氯芬酸乙酯、醋氯芬酸乙酯、醋氯芬酸叔丁酯3种，此方法可作为醋氯芬酸原料药的质控方法。胡楚楚等[18]采用HPLC/QTOF-MS联用技术对西尼地平的主要光降解杂质进行结构分析，通过比对合成杂质和光降解杂质的紫外光谱、液相色谱保留时间和二级质谱数据，进一步确认该光降解杂质为西尼地平Z-异构体；并同时确认西尼地平片及胶囊的光降解杂质均为西尼地平Z-异构体，该研究对西尼地平及其制剂杂质分析、质量控制具有参考作用。

2 在药物体内代谢研究中的应用

药物体内代谢研究是当今药学领域研究最多、发展速度最快的研究领域，它是通过分析人和动物体液及各组织器官中药物及其代谢物浓度，了解药物在体内数量和质量的变化，获得药物代谢动力学的各种参数和转变以及代谢的方式、途径等信息，从而有助于药物的研究、临床合理应用等。

乔湜等[19]采用UHPLC/QTOF-MS技术分析鉴定止咳宝片在大鼠血浆中的代谢产物，鉴定出了5个阿片类生物碱、甘草苷和甘草酸及其相关代谢产物31个；5种阿片类生物碱、甘草苷和甘草酸在大鼠体内的代谢途径包括葡萄糖醛酸化、硫酸化、脱甲基化、脱氨基甲基后羧基化、水解等。程宇欣等[20]采用UHPLC/QTOF-MS技术鉴定吴茱萸水提物在大鼠血浆、尿液及粪便中的代谢产物，通过分析各成分的保留时间、精确分子质量、一级、二级质谱信息并与相应的对照品比对，得到吴茱萸水提物在大鼠血浆、尿液和粪便中代谢产物35个，吴茱萸水提物在大鼠体内代谢的主要途径有羟基化、氢化、甲基化、硫酸化、葡糖醛酸化等。苏联麟等[21]采用UHPLC/QTOF-MS技术对生、醋五味子醇提物在大鼠血浆、胆汁、尿液、粪便中代谢过程进行分析，得出生、醋五味子醇提物在大鼠体内主要发生去甲基化、羟基化、氧化等代谢转化，最终在生、醋五味子组中共鉴定出6种木脂素原形成分及它们的20种代谢产物。高家荣等[22]运用UPLC/QTOF-MS技术对丹蛭降糖胶囊防治2型糖尿病血管病变大鼠进行血清代谢组学研究，结果，丹蛭降糖胶囊可以保护血管内皮细胞，防治2型糖尿病血管病变，其作用机制可能在于调节氨基酸代谢、胆汁酸和脂代谢以及氧化应激状态相关。徐静静等[23]采用UPLC/QTOF-MS法分析并鉴定盐酸丁咯地尔在人血浆和肝微粒体孵化体系中的代谢产物，通过与空白生物样品进行比较，在人血浆和肝微粒体中共发现了丁咯地尔及其24种代谢产物，其中18种为首次发现的代谢产物，阐明了丁咯地尔在人体的代谢途径，包括去甲基化、氧化、羟基化、硫酸和葡萄糖醛酸结合途径。

3 在生物大分子研究中的应用

随着医药研究技术的发展，人类治疗疾病的药物也不再局限于化药和天然药物，生物制剂开始逐渐走进药学领域的研究，而生物大分子药物（多肽、蛋白质、抗体、聚糖与核酸）也以其高效、低毒的优点被广泛应用于抗肿瘤、艾滋病、心脑血管病、肝炎等重大疾病中，但生物大分子药物的使用方面也有一些未解决的难题和障碍，如难以透过细胞膜、结构复杂、分离纯化困难、稳定性低等一系列问题，因此，对生物大分子药物的研究更为重要。高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用技术作为一种有效的分析方法在此领域得到应用。Henry等[24]应用液相色谱-质谱联用（LC/MS）对单克隆抗体（曲妥珠单抗，人源化单克隆免疫球蛋白IgG1）的结构进行深度表征，结果表明，应用LC/MS对曲妥珠单抗的完整蛋白及其亚基（轻链和重链）的相对分子质量测定得到良好的质量准确度，由此可判定特定蛋白修饰在轻链和重链上的分布；通过对曲妥珠单抗酶解后的氨基酸全序列确认，可对其翻译后修饰以及可能的错误氨基酸序列进行解析。李响等[25]通过胰蛋白酶酶解蛋白，PNGase F去除多肽混合物中糖肽的糖基化，将去糖后的总肽用于液相色谱-质谱联用系统，经液相分离后，通过LC-ESI-Q-TOF完成了融合蛋白FP3的76%氨基酸序列测定，通过LC-ESI-Trap完成余下24%氨基酸序列测定。赖玮毅等[26]用反相离子对色谱串联电喷雾四级杆飞行时间质谱的方法，以乙酸铵为离子对试剂，用于检测固相合成的寡核苷酸的纯度以及酶活性试验中寡核苷酸分子量的变化，检测了带有5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC）的RNA寡核苷酸经tet蛋白催化氧化前后的样品，成功检测到了底物5mC RNA寡核苷酸及其氧化产物 5羟甲基胞嘧啶RNA寡核苷酸的多电荷峰，证明了 tet蛋白不仅对DNA中的5mC有催化氧化作用，对RNA中的5mC也有催化活性。

4 结论

HPLC/QTOF-MS的出现，改变了人们对以前传统药物分析的认知，让相关人员对药物的分析更加快捷、简单、准确，大大减少了药物分析工作人员的工作量，使药物分析工作效率变得更高，极大地加快了人类在药学领域前进的步伐，使更多的新药产品得以问世，解决了更多的疑难杂症。目前HPLC/QTOF-MS技术在药物分析方面分析范围广、特异性强、检测灵敏度很高，对一些珍贵药物只需微量即可检测；HPLC-MS连用仪器有多种数据处理软件和工具，极大地方便对数据的分析。在互联网数据大时代，天然药物、化药和生物制药的数据库不断扩充，药物中的各类化学成分的指纹图谱不断建立，高效液相色谱/飞行时间质谱联用技术的应用领域将会不断扩大，对科学领域做出的贡献也会越来越多。