ETEC 破坏肠上皮细胞紧密连接作用的研究进展

徐倩倩 ,郭时金 ,王玉波 ,王艳萍 ,董 林 ,王金良 ,沈志强

(1.山东省滨州畜牧兽医研究院 山东省滨州畜禽蜂胶疫苗研究开发推广中心,山东滨州256600 ;2.山东绿都安特动物药业有限公司,山东滨州256600 ;3.滨州医学院附属医院胸外科,山东滨州 256600)

动物肠腔内存在大量共生菌,这些细菌大部分有助于肠道功能的维持与健康[1]。然而,病原菌进入肠道就会引起感染,肠道病原菌与宿主上皮细胞的相互作用多与毒素相关。产肠毒素型大肠杆菌(ETEC)是农场动物大肠杆菌性腹泻最常见的病原菌。ETEC 的致病性始于对宿主小肠上皮细胞的粘附,随之而来的是肠毒素的分泌,引发急性水样腹泻,伴随着炎症和屏障功能的破坏。ETEC 能产生2类毒力因子,26 种粘附素使其在肠上皮细胞粘附和定植,3 种肠毒素引发液体分泌[2]。ETEC 产生的肠毒素与肠道上皮细胞相互作用能够破坏肠道紧密连接,造成屏障功能障碍,水和离子以被动吸收的方式进入肠腔,引发腹泻。

1 紧密连接的结构

胃肠道(GI)上皮细胞形成了机体与外界环境接触的最大表面。相邻细胞间有细胞间连接。细胞间连接的重要功能就是形成选择性屏障[3]。肠细胞间通过4 种不同类型的连接互相结合。这些特殊的复合物包括紧密连接(Tight junctions,TJ)、粘附连接(Adherens junctions,AJ)、细胞桥粒和缝隙连接。顶端连接复合物的每个连接都是由3 个亚组件构成:跨膜蛋白、细胞骨架部分和胞质骨架蛋白。AJ 位于TJ 的底外侧,由跨膜蛋白E-钙粘着蛋白与连环蛋白家族的胞质蛋白相互作用形成。AJ 和细胞桥粒提供上皮细胞间强有力的粘合键,有利于细胞间信号传导,但不参与细胞渗透性调节。TJ 具有动态结构,是转运支路的主要屏障。

TJ 是复合蛋白结构,包括跨膜蛋白,通过它连接于细胞骨架。4 个完整的跨膜蛋白,闭合蛋白、闭锁蛋白、连接粘附分子(Junctional adhesion molecules,JAMs)和tricellulin,形成半渗透性屏障。这些跨膜蛋白与细胞质骨架蛋白相互作用的细胞内区域,如闭锁小带(Zonula occludens,ZO)蛋白反过来将跨膜蛋白锚定到连接周围肌动球蛋白环和肌动蛋白丝。胞浆蛋白将膜成分连接到细胞骨架并参与TJs 和细胞核间的信号传导。TJs 通过细胞内支架蛋白和细胞骨架调节分子构成、超微结构和功能。在细胞培养的感染性试验中,通常将测定跨上皮细胞电阻抗(Transepithelial resistance,TER)作为屏障功能的评价指标。屏障损坏对应着TJ 屏障空隙的增多,伴随着可见的分子通道,如葡聚糖、甘露醇和菊糖。然而,多孔性与TER 改变并非同步。

1.1 闭合蛋白 闭合蛋白是TJ 的主要成分和支柱。闭合蛋白在多种组织的屏障形成和细胞渗透性、选择性方面都发挥了关键作用。目前至少鉴定了27 种闭合蛋白[4]。闭合蛋白调节肠道上皮细胞的物质转运。在肠道,闭合蛋白-1、-3、-5、-8、-9、-11 和-14 为屏障形成闭合蛋白,而-2、-7、-12 和-15 则是孔形成闭合蛋白。这类蛋白的高表达,会导致上皮细胞更加紧密、TER 增高、上皮细胞单层的不渗透性增强。闭合蛋白严格控制了阳离子和阴离子跨细胞流动。相邻细胞间的闭合蛋白,有的能够形成细胞间连接,而有些则不能。它们对于TJs 的屏障功能尤为重要。一些闭合蛋白是磷酸化的,磷酸化程度与其在细胞的定位和细胞渗透性有关。

1.2 闭锁蛋白 闭锁蛋白是一种完整的膜TJ 蛋白,呈现4 个跨膜域。闭锁蛋白从TJ 向细胞质囊泡的移动通常会导致屏障功能丢失改变上皮细胞通透性。闭锁蛋白在TJ 结构和肠上皮细胞屏障功能维持中发挥重要作用。闭锁蛋白在TJ 内一般是磷酸化状态,而在基底外侧膜和胞浆中磷酸化状态则较为少见。闭锁蛋白长长的C-端域与多种细胞内TJ 蛋白相互作用,如ZO 蛋白,将闭锁蛋白连接到肌动蛋白细胞骨架上[5]。闭锁蛋白在TJ 结构和肠上皮细胞渗透性方面都发挥了重要作用,细胞外环与邻近细胞相互作用,形了能阻挡大分子但不能阻挡小离子的屏障。

1.3 JAM JAM 家族属于免疫球蛋白(IG)超家族,其特点为细胞外IG 域,1 个跨膜域和1 个细胞外域。JAS 参与多种功能,包括TJ 组装、内皮细胞及上皮细胞转运通透性调节[4]。

1.4 ZO 目前已鉴定了3 种ZO,包括ZO-1,ZO-2和ZO-3[4]。它们是细胞浆蛋白,为TJ 结构的调整和维持所必须。ZOs 属于膜相关鸟苷酸激酶蛋白大家族。ZOs 在TJ 的细胞质侧形成一种复合物。ZO-1 位于上皮细胞和内皮细胞TJ 等离子膜附近,与激动蛋白细胞骨架相互作用。ZO-2 和ZO-3 为外周蛋白,是ZO-1 的结合蛋白。许多TJ 蛋白结合于ZO蛋白N-末端区域,而C-末端区域与肌动蛋白细胞骨架相互作用。在细胞培养和动物模型中,ZO-1 都是位于初期细胞间的连接。据推测,ZO 蛋白可能介导TJ 蛋白的初期装配并形成细胞间连接。

1.5 Tricellulin Tricellulin 是在3 个相邻细胞间形成连接的TJ 蛋白。Tricellulin 是一种四分子交联体蛋白,有4 个跨膜域和2 个细胞外环。研究发现,Tricellulin 在三细胞连接和两细胞连接的上皮细胞TJ 调节中都发挥了重要作用。

1.6 肌动蛋白 肌动蛋白细胞骨架的结构对TJ 的功能至关重要。肌动蛋白细丝对于维持细胞形状和上皮细胞屏障的完整性都非常重要。在极化细胞,顶端区域含有大量肌动蛋白微丝,它们以多种结构存在。肌球蛋白和肌动蛋白形成一个环(连接周围肌动蛋白肌球蛋白环),从TJ 和AJ 水平将细胞环绕[6]。

2 ETEC 肠毒素对TJ 的破坏

肠毒素是致病性微生物产生的蛋白或者肽,作用于消化道,特别是小肠上皮细胞,破坏其TJ 结构,导致栅栏和门控功能失效。主要产生热不稳定性毒素(Heat-labile toxin,LT) 和热稳定性肠毒素(Heat-resistant,ST)。ST 是低分子量毒素,能够耐受100 ℃15 min,而LT 在60 ℃15 min 即可失活。这2 种毒素都是质粒编码,并且毒力特性可在大肠杆菌菌株之间转移[7]。这些分子具有非常强的毒性,纳摩级浓度甚至更低即可引起肠道稳态的破坏。ETEC 菌株造成的感染,表现为上皮细胞通透性屏障破坏,很难将这种破坏直接归因于一种或几种肠毒素,但却都与K88 血清型有关[8]。

Egberts 等发现3 周大的仔猪人工感染ETEC(O145、K91、K88),与未感染的空白对照组相比,猪空肠上皮细胞TJ 数量明显减少,TJ 键的排列变得松散,但对辣根过氧化物酶(MW=44 kDa)的通透性没有发生变化,说明尽管连接的键数量减少,TJ的屏障功能没有受到影响。也有研究发现,仔猪感染ETEC 后,小肠对小分子的通透性增加,绒毛变短,隐窝加深,空肠闭锁蛋白、ZO-1 和ZO-2 以及回肠闭合蛋白-1、ZO-1 和ZO-2 表达减少[9-10]。相反,Roselli 等[11]通过测定人Caco-2 细胞TER 发现,猪ETEC 株(K88)降低TJ 通透性,使ZO-1 移位,并降低猪IPEC1 肠道上皮细胞闭锁蛋白的丰度。

2.1 LT LT 是AB5 型高分子量毒素(大约85 kDa)。它在结构、功能和作用机制方面与霍乱毒素(Cholera toxin,CT)都十分相似。LT 全毒素由一个酶促激活A(30 kDa)亚单位(ADP-ribosylating)结合于5 个受体结合B(11.5 kDa)亚单位构成。A 亚单位包括含有活化位点的A1 片段和将A1 结合于B亚单位的A2 片段。LT-B 亚单位的受体在肠细胞广泛存在,包括GM1 神经节苷脂、GD1b,去唾液酸GM1、一些乳蛋白和含半乳糖糖脂。GM1 神经节苷脂是LT-1 的首选受体。LT-1 通过B 亚单位与受体结合后,A 亚单位通过受体介导的内吞作用内化进入细胞。通过逆行转运,转运至高尔基体和内质网(Endoplamic reticulum,ER)。在高尔基体解体后,A亚单位转移到ER,在此被剪切为A1 和A2 两份。A1 片段转移到胞液,导致肠细胞基底侧膜腺苷酸环化酶激活[5]。腺苷酸环化酶的激活导致细胞内cAMP 蓄积,以及囊纤维化跨膜调节因子(Cystic fibrosis transmembrane regulator,CFTR)的活化,伴随着蛋白激酶A(Protein kinase A,PKA)磷酸化。Cl-和HCO3-从这个开放的通道分泌。同时,PKA 通过钠氢交换体3(Na+/H+-exchanger 3,NHE3)磷酸化抑制Na+被绒毛细胞再吸收。渗透压作用导致水分泌增多,引发腹泻。LT-1 的作用是不可逆的,可以被抗CT 抗体中和。

LT 对不同细胞株可能表现为不同的作用。猪ETEC 菌株明显降低IPEC-J2 细胞的TER,未见TJ蛋白(ZO-1,ZO-2,ZO-3、闭合蛋白、闭锁蛋白和JAMS)表达或者分布有明显改变。推测TER 的改变可能归因于ETEC 对宿主离子通道功能的作用而不是TJ。ETEC 菌株与极化T84 上皮细胞单层共培养3 h 可引起TER 下降[12],对于产LT 菌株,这种现象感染后48 h 出现逆转,而在产STa 菌株则未出现。LT 肠毒素不仅通过破坏TJ 引起T84 细胞单层TER 下降,还导致葡聚糖-FITC(4 kDa)通道破坏。弗斯可林(cAMP 诱导物)处理缺乏葡聚糖通道细胞说明LT 通过一种非cAMP 依赖性途径引起对大分子的通透性。ADP -核糖基活性降低、LT-B 亚基减少突变证实TER 降低仅出现在单层细胞受功能性LT 肠毒素处理或者产LT ETEC 菌株处理后,伴随着对FITC-葡聚糖通透性的增高。数据显示,产LT ETEC 菌株诱导肠道通透4～67 kDa 分子的屏障功能障碍,该作用依赖于LT ADP-核糖基活性。

2.2 ST STs 是一类由一些大肠杆菌菌株产生的低分子量微粒。ETEC 主要产生两类ST,为STa 和STb。STa 主要与人类腹泻有关,STb 在人类腹泻病例中也有分离到,但主要引起动物腹泻,特别是猪腹泻[13]。

2.2.1 STa STa 是一种18-(猪STa)或者19-氨基酸(人STa)富含半胱氨酸肽,分子量大约2 000 Da。2 个亚类的氨基酸序列不同,但两者都含有3 个二硫键。二者在仔猪体内都有活性。总起来说,从氨基端半胱氨酸到羧基端半胱氨酸13 个氨基酸序列是其毒性的关键。STa 结合于肠道上皮细胞刷状缘绒毛的糖蛋白受体鸟苷酸环化酶C(Guanylate cyclase C,GC-C)的细胞外区域。结合后,GC 细胞内催化位点激活,导致cGMP 产生,并在细胞内聚集。cGMP 水平增高激活cGMP 依赖性蛋白激酶Ⅱ,使得Cl-通道CFTR 磷酸化。CFTR 激活,导致Cl-和HCO3-分泌。cGMP 增高还会抑制磷酸二酯酶3(Phosphodiesterase 3,PDE3),增高了cAMP 水平,激活PKA。PKA 使CFTR 磷酸化,还可以使NHE3 磷酸化,抑制Na+的再吸收[13]。STa 的作用是可逆转的。

STa 肠毒素与鸟苷酸,一种生理性的GC 激活剂,呈现相似的作用。STa 在4 μM 以上的浓度,培养2 h 即可造成T84 上皮极性细胞单层TER 的降低,但鸟酐蛋白却不能;然而,利用FITC-葡聚糖(4 kDa)的转运通道测定进行评价时,STa 或者鸟酐蛋白均不能增加细胞通透性,说明STa 不仅增加水分泌,还会破坏屏障功能[14]。因为TER 下降的部分,浓度都在4 μM 以上,说明STa 引发TER 下降仅出现在有限的上皮细胞位点,可能是ETEC 粘附并且产生STa 毒素的位点。数据显示STa 通过GC-C激活引发水分泌,同时在诱发肠道屏障障碍中也发挥了作用。STa 对TER 的作用研究虽然较少,但它可能在ETEC 的发病机理中占重要作用。

2.2.2 STb STb 为48 个氨基酸的肽,分子量为5 200 Da,2 个二硫键。这类毒素的序列和作用机制均与STa 无关。STb 无需激活腺苷酸或者GC 即可引发腹泻。它与肠道上皮细胞的鞘糖脂,硫苷脂结合。STb 与其受体的结合引发内吞作用,使其内化。一旦进入细胞,STb 即可激活GTP 结合调节蛋白,Ca2+被摄入到细胞,激活CAMKⅡ,一种钙调蛋白依赖性蛋白激酶。该酶使CFTR 磷酸化,引发Cl-和HCO3-分泌。细胞内Ca2+水平增高还可激活蛋白激酶C(Protein kinase C,PKC),这种酶也作用于CFTR,并通过一种尚不明确的通道抑制Na+吸收。CAMKII 还能打开钙激活氯离子通道(Calcium-activated chloride channel,CaCC)。同时,Ca2+水平的最初升高通过磷脂酶A2 和C 活化刺激膜脂促分泌素前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)合成。在肠嗜铬细胞内,这些酶产生 5-羟色胺 (5-hydroxytryptamine,5-HT)。5-HT 作用于肠道神经系统,使肠壁平滑肌收缩,造成液体的排出。这些改变导致十二指肠和空肠分泌水和电解质。STb 的作用是可逆的。

单独用STb 毒素处理T84 极化细胞单层,能引起TER 显著降低,而单个氨基酸突变(D30V)无生物学活性的肽则不能降低[15]。转运通透性的增加与F-actin 张力纤维的巨大改变有关。共聚焦显微镜观察发现,F-actin 细丝溶解和缩合伴随着ZO-1,claudin-1 和闭锁蛋白的重排和/或分裂。该结果与STb 中一段8 氨基酸肽处理细胞一致,也与霍乱弧菌Zot 毒素作用后一致,但与T84 细胞受杂乱肽处理结果不同。这个8 肽负责与STb 和Zot 毒素受体结合。对于Zot 毒素,该8 氨基酸序列还参与TJ 重排。因此,STb 引发TJ 开放,表现为TER 明显下降,细胞对大分子量标记物(FITC-BSA=47 kDa)通透性增加,与其导致TJ 蛋白重新分布和肌动蛋白细胞骨架重排有关。采用免疫印迹和共聚焦显微镜观察,发现STb 处理后T84 细胞单层claudin-1 的重新分布[16],从膜转移到细胞液中。同时,Dreyfus 等推测了钙在STb 活性机制中的作用,在细胞培养基中增加Ca2+后,屏障功能的破坏速度明显增加。膜claudin-1 的消失伴随着去磷酸化。总之,STb 处理导致claudin-1 在细胞的重新分布,从细胞膜转移到细胞质位点。TJ 膜claudin-1 磷酸化的消失可能导致了渗透性的增加。STb 通过改变TJ 蛋白造成上皮细胞屏障破坏,最终导致腹泻。

3 展望

ETEC 是引发人类和幼畜腹泻的重要原因。ETEC 产生各种LT 和ST 肠毒素通过对肠道上皮细胞TJ 产生破坏作用。很明显,除了对离子通道的活性作用,毒素还影响到上皮细胞的通透性。在ETEC 感染引发水样腹泻中,ETEC 引发的TJ 破坏到底发挥了怎样的角色仍需进一步研究。从控制肠离子通道和保护TJ 的角度预防和治疗ETEC 引发的腹泻无疑也是一个突破点。