异丙肾上腺素所致心肌损伤动物模型的研究进展

梁娟，刘越，尹新华*

(1. 哈尔滨医科大学附属第一医院，哈尔滨 150001； 2. 哈尔滨医科大学附属第一医院心内科，哈尔滨 150001)

美国流行病学数据表明心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)是目前世界上最常见的导致人类死亡的原因，占全球总死亡人数的31.5%[1]。在我国，最新流行病学证据也表明CVD患病率及死亡率仍处于上升阶段，而心血管死亡占城乡居民总死亡原因的首位，农村为45.01%，城市为42.61%[2]。因此，CVD是世界公共卫生及健康事业所面临的严峻挑战，亟需进一步临床与基础研究。动物模型一直是心血管基础研究常被用到的方法，用于揭示疾病的发病机制和观察干预的效果。ISO是一种β-肾上腺素能受体激动剂，通过加快心率、增强心肌耗氧量引发心肌损伤，其发病机制主要与炎症反应、氧化应激、内质网应激、自噬和凋亡等机制有关，表现出许多与人类心脏病相似的代谢和形态学异常，模拟缺血性心肌损伤、药物性心肌损伤、2型心肌梗死等疾病[3]。因此，本文从形态与功能学特征、发病机理等方面阐述ISO所致的动物心肌损伤模型，从而有助于深入理解其在基础研究中应用的意义。

1 ISO诱导心肌损伤动物模型的形态与功能学特征

ISO所致心肌损伤的动物模型包括轻度心肌损伤、心肌梗死、心肌肥厚甚至心力衰竭等。根据ISO给药的剂量和持续时间分为三种情况：低剂量ISO所致心肌损伤模型，例如心肌肥厚，多用5 mg/(kg·bw)，时间至少1周，多至4周；中等剂量ISO所致心肌梗死模型，通常用ISO 10 ～ 120 mg/(kg·bw)连续两次或多次皮下注射方式；高剂量ISO所致心肌梗死模型，ISO 150 ～ 400 mg/(kg·bw)以单次剂量或连续两次施用。高等剂量ISO所致心肌梗死模型的成模率高于中等剂量ISO，但同时伴随着更高的实验动物死亡率。

1.1 低剂量ISO所致心肌损伤模型

低剂量ISO 5 mg/(kg·bw)作用7 d或14 d可诱导以心肌纤维化和坏死为特征的心肌肥厚模型。在ISO 5 mg/(kg·bw)皮下注射7 d后24 h，雄性Wistar大鼠(2 ～ 3月龄，n=7，来自斯洛伐克共和国的Dobra’Voda育种站)体内心脏和离体心脏模型的心电图检查发现体内心脏的QRS时间和QT间期分别延长了8%和53%，I导联可见R波振幅增加，部分出现ST-T改变，而离体心脏R波振幅较体内心脏更高，QT间期延长了55%。一般认为，QT间期延长为复极异常的表现，与室性心律失常风险增加有关。ISO组大鼠的离体心脏中，室性早搏数量较正常组离体心脏明显增多[4]。同时，ISO 5 mg/(kg·bw)腹腔注射7 d后雄性SD大鼠(140 ～ 160 g，来自西安交通大学实验动物中心)心脏重量显著增加，血清BNP及其在心脏中的mRNA表达水平升高[5]。而且，ISO 5 mg/(kg·bw)腹腔注射7 d的雄性Wistar大鼠(180 ～ 200 g，n=6，来自沙特国王沙特大学药剂学院实验动物中心)的血浆cTnI和CK-MB水平显著升高，进一步的心肌组织HE染色发现左心室局灶性心内膜下退化，伴有许多单核细胞浸润灶；而Masson染色可见左心室心肌细胞特别是在内皮下区域的肌内膜中有较多的纤维组织沉积[6]。与之一致，在5 mg/(kg·bw)皮下注射14 d诱导的雄性SD大鼠(200 ～ 250 g，n=10，来自印度海得拉巴的蒂娜实验室)中，在实验第13天的心电图上呈现心率加快、QT间期延长和R波振幅增加。同时ISO组大鼠心肌组织中ANP、β-MHC及胶原mRNA的表达量较盐水对照组显著增加[7]。上述现象表明肾上腺素能过度激活导致心肌损伤坏死、纤维化进而发生心肌肥厚，同时伴随着心脏功能下降。

1.2 中等剂量ISO所致心肌损伤模型

通常以连续两次或多次剂量给予中等ISO建立啮齿类动物的急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)模型。在中等剂量的ISO 85 mg/(kg·bw)皮下注射2 d干预的成年雄性Wistar大鼠(170 ～ 200 g，n=10，来自印度新德里医学科学研究院中心畜舍设施)中，血清CK-MB和LDH水平显著增加；组织病理学检查显示心肌明显水肿，伴炎症改变及坏死；超微结构检查示心肌细胞线粒体肿胀和嵴的空泡化破坏[8]。值得一提的是，有文章报道采用ISO剂量梯度递减法并延长给药时间方式诱导的心肌梗死模型较ISO 85 mg/(kg·bw)短期给药方式更稳定，而且实验动物生存率更高[9]。研究发现即使ISO代谢清除后损伤的心肌仍会继续发生重塑，导致心肌肥厚、心室扩张和心脏功能障碍，这些改变与ISO给药剂量成正比[10]，甚至可能在ISO给药后9周仍有心电图变化、纤维化进展和TNF水平升高[11]。与之相反，Shao等[10]报道中等剂量ISO 50～100 mg/(kg·bw)所致的心肌损伤是一个可逆过程，但仍有待进一步研究。

1.3 高剂量ISO所致心肌损伤模型

高剂量的ISO 150～340 mg/(kg·bw)诱导弥漫性心肌坏死，甚至诱发恶性心律失常。有研究报道单剂量ISO 200 mg/(kg·bw)皮下注射给药后24 h血清CK-MB和cTnI水平分别升高为对照组的2～3倍和15～20倍[12]。有意思的是， Markus等[13]给予野生型C57BL/6小鼠(10～12周龄，来自美国缅因州巴尔港杰克逊实验室)单剂量ISO 200(n=5)、300(n=1)、400(n=4)、500(n=1)、 600(n=1)、700(n=1)、800(n=1)和1000(n=5)mg/(kg·bw)，并对给予200、300、400、1000 mg/(kg·bw)的小鼠行心电图检查以探索各剂量ISO对小鼠心脏的影响。结果发现400、1000 mg/kg ISO给药的小鼠心电图最初表现为心率略增加，随后几分钟出现窦性停搏、心室传导阻滞、室性逸搏心律，而终止于室性心动过速或心脏停搏，因此推测啮齿类动物可耐受的ISO最高非致死剂量为300 mg/kg，故选取200及300 mg/(kg·bw)剂量用于后续实验研究。进一步发现单剂量ISO 200 mg/(kg·bw)或300 mg/(kg·bw)皮下注射后1 d，小鼠心脏收缩功能瞬时增加，舒张功能无变化，血清cTnI水平升高。通过伊文思蓝染料(EBD)摄取评估表明ISO可以改变心肌细胞的膜通透性而不一定导致坏死。EBD + 心肌细胞存在于整个心室内，而不仅局限于左心室心内膜或心尖区域。然而，另一研究给予16周龄野生型C57BL/6小鼠从50 mg/(kg·bw)起始逐渐递增的单剂量ISO，直至在单剂量ISO 400 mg/(kg·bw)后2 h小鼠中检测到明显的节段性心脏功能障碍，但并不导致小鼠直接死亡[14]。因此，300 mg/kg ISO是否为啮齿类动物可耐受的最高非致死剂量仍有待进一步研究。

2 ISO诱导心肌损伤模型的发病机理

2.1 炎症反应

炎症免疫反应在ISO所致心肌损伤中发挥重要作用。既往研究发现，ISO可以诱导包括TNF-α、IL-1β、IL-6在内的多种心肌炎性因子的表达[15-16]。另外，雄性C57BL/6小鼠模型细胞因子阵列分析ISO对心肌的作用，发现趋化因子在心脏内特异性上调的初始细胞因子中起主导作用，促进了早期巨噬细胞的浸润，增强细胞炎症免疫反应，间接导致心肌损伤增加的趋化因子包括单核细胞趋化蛋白(MCP)-1、MCP-5、巨噬细胞炎性蛋白-1a(MIP-1α)和C-X-C趋化因子10(CXCL-10)，均在ISO处理后12 h达到最高表达水平。相比之下，升高的促炎性细胞因子(如IL-6和TNF-α)直到24 h才被检测到，并持续到ISO给药后72 h。相反，在此过程中未检测到T细胞，B细胞和中性粒细胞。进一步的研究发现，IL-18(而非IL-1β)的快速炎症体依赖性激活是由ISO诱导的β1-AR-ROS信号介导的，是心肌中上调趋化因子表达的关键上游调控因子。IL-18或上游炎性小体成分NLRP3的基因缺失使异源性趋化因子的表达和炎细胞因子、粘附分子、巨噬细胞的浸润明显下降，从而有效减轻心脏炎症和纤维化。但是，炎症反应在ISO所致的心肌损伤的发病中作用仍有待进一步阐明[17]。

2.2 氧化应激及脂质过氧化

研究表明ISO处理的成年雄性Wistar大鼠(170 ～ 200 g，n=10，来自印度新德里医学科学研究院中心畜舍设施)抗氧化酶水平显著降低，如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽等；而丙二醛水平升高[8]。ISO还能够引起电压敏感Ca2+通道打开和过度的Ca2+内流，使心肌收缩增强，进而增加氧需求，导致ATP消耗和呼吸链中的电子泄漏。这些释放的自由电子与分子氧反应形成活性氧基团(reactive oxygen species，ROS)，进一步氧化蛋白质、DNA和膜脂质等细胞组分，直接损伤心肌。此外，ROS引发TNF-α和IL-6等炎性细胞因子的释放会导致肌质网中Ca2+泵的持续抑制，间接对心肌细胞产生负面影响[18]。此外，ROS导致脂质膜破坏使LDH和CK-MB等胞质酶释放入血液中，因此通过检测ISO组大鼠血清中的这些胞质酶可判断是否存在心肌损伤[19]。

同时，ISO使心脏组织中脂质积聚并发生脂质过氧化从而导致心脏功能障碍。研究显示ISO 85 mg/(kg·bw) 2 d导致雄性白化Wistar大鼠(120 g，n=8)血清总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇、极低密度脂蛋白胆固醇和脂质过氧化的浓度显著增加，而高密度脂蛋白胆固醇浓度显著降低。重要的是，ISO处理后卵磷脂胆固醇酰基转移酶、对氧磷酶和脂蛋白脂肪酶的活性显著降低，而3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA)的活性显著增加[20]。这些表明脂毒性与儿茶酚胺引起的心肌功能障碍密切相关。

2.3 内质网应激(Endoplasmic reticulum stress，ERS)

ERS能够调节蛋白质折叠和运输以及细胞内钙浓度等不同细胞过程,参与高血压、心肌缺血和扩张型心肌病等多种导致心力衰竭的心脏疾病[21]。ISO 5 mg/(kg·bw)作用7 d诱导的雄性C57BL/6小鼠(6 ～ 8周，20 ～ 25 g，来自美国缅因州巴尔港杰克逊实验室)心力衰竭模型中，ISO能够显著上调心肌组织中GRP78蛋白表达，进一步激活其下游的PERK、IRE1和eIf2a来启动ERS[22]。在ISO所致的雄性Wistar大鼠(200 ～ 250 g，n=20，来自哈尔滨医科大学实验动物中心)心肌损伤模型中，ISO能够使心肌中ER伴侣蛋白和相关凋亡蛋白明显增加；应用钙受体(calcium receptor，CaR)激活剂calindol后ER伴侣蛋白的表达和凋亡率有所增加，而应用CaR阻断剂calhex231后上述蛋白的表达降低。ISO处理48 h后，CaR活化使肌浆网内Ca2+浓度降低、线粒体内Ca2+浓度升高，从而降低线粒体膜电位，使ER应激伴侣蛋白及相关凋亡蛋白的表达增强，表明钙敏感受体通过内质网应激在ISO所致心肌损伤发挥着重要的作用[23]。同时,另一研究表明ISO抑制AMPK活化并增强ERS，随后导致心肌细胞凋亡[24]。

2.4 自噬

自噬是依赖溶酶体途径对胞质蛋白和细胞器进行降解的一种过程，，参与细胞更新和稳态的维持。自噬在许多疾病的发病过程中发挥重要作用，如癌症、神经退行性疾病、炎症反应和其他心肌病[25]。自噬依赖性心肌细胞死亡已在心肌梗塞动物模型中得到证实，然而却很少有研究报道自噬是否可以影响心脏成纤维细胞活化。因此，Dong等[26]假设自噬可以促进成纤维细胞在增殖和分化中的激活，使用Toll样受体4敲除(TLR4 KO)小鼠作为自噬不足的阴性对照。结果表明TLR4 KO减轻ISO诱导的心脏纤维化，该效应可能与抑制自噬有关。因此，推测适度抑制自噬活性可能是治疗心脏纤维化的新策略。相反，Lu等[27]却发现ISO诱导原代新生大鼠心肌细胞(NRCMs)发生肥大反应并抑制该细胞自噬活性，而SIRT6诱导的自噬可能通过抑制Akt信号传导来减轻ISO诱导的心脏肥大，并推测促进自噬可能成为治疗心脏肥大的有效方法。自噬在心肌损伤中的作用犹如一把双刃剑，被生物体微妙地调控着。

2.5 凋亡

Fas配体(FasL)及其受体Fas(CD95/APO-1)均参与细胞死亡调控，被认为是心肌梗死、缺血再灌注(I-R)损伤和慢性心力衰竭等多种心脏病理的重要因素[28]。有证据表明细胞外基质蛋白CCN1/Cyr61能够促进FasL和TNF家族细胞因子的细胞毒性。在ISO诱导的心肌损伤模型中，CCN1通过增加ROS和细胞表面Fas的表达提高细胞对fas所诱导细胞凋亡的敏感性，使心肌细胞更容易受到应激性心脏的死亡刺激，提示阻断CCN1可能减轻小鼠心肌损伤[29]。

ISO 通过炎症反应、氧化应激、内质网应激、自噬和凋亡等机制直接和间接地诱导形成心肌损伤动物模型。这些机制并不是独立存在的，而是通过各种方式相互联系、相互影响的。关于ISO建立实验性心肌损伤模型的机制仍存在许多未知，有待进一步研究。

3 展望

ISO通过炎症反应、氧化应激、内质网应激、自噬和凋亡等机制直接和间接地引起心肌损伤。这些机制并不是独立存在的，而是通过各种方式相互联系、相互影响的。ISO建立的实验动物模型，包括病理性心肌损伤、心肌梗死、心肌肥厚和心力衰竭等，有助于我们深入理解β-肾上腺素能受体刺激下发生的病理变化和病理机制并找到治疗交感神经过度活化的最佳途径。在大鼠心脏中由单次、两次或多次过量ISO引起的急性心肌梗塞症状与人类相似，因此使用ISO模型作为合并HF的非侵入性AMI模型尤为适用。同时，对该动物模型的体外和体内观察为β-肾上腺素能受体过度刺激引起左室重塑和心力衰竭患者的治疗提供了合理机制。最近有研究表明ISO所致心肌损伤可能还与E2/ER β受体等有关[30]。由此可见，ISO诱导实验性心肌损伤模型仍有待进一步研究，其在心血管疾病诊疗方面具有重要意义和广阔前景。

参考文献

[1] Benjamin EJ, Blaha MJ, Chiuve SE, et al. Heart disease and stroke statistics - 2017 update: a report from the American Heart Association [J]. Circulation, 2017, 135(10): e146-e603.

[2] 陈伟伟，高润霖，刘力生，等.中国心血管病报告2017概要 [J]. 中国循环杂志, 2018, 33: 1-8.

Chen WW, Gao RL, Liu LS, et al. China cardiovascular disease report 2017 summary [J]. Chin Circul J, 2018, 33: 1-8.

[3] Nichtova Z, Novotova M, Kralova E, et al. Morphological and functional characteristics of models of experimental myocardial injury induced by isoproterenol [J]. Gen Physiol Biophys, 2012, 31(2):141-151.

[4] Mikusová A, Králová E, Tylková L, et al. Myocardial remodelling induced by repeated low doses of isoproterenol. Can J Physiol Pharmacol [J]. Can J Physiol Pharmacol, 2009, 87(8):641-651.

[5] Zhuo XZ, Wu Y, Ni YJ, et al. Isoproterenol instigates cardiomyocyte apoptosis and heart failure via AMPK inactivation-mediated endoplasmic reticulum stress [J]. Apoptosis, 2013, 18(7): 800-810.

[6] Al-Rasheed NM, Al-Oteibi MM, Al-Manee RZ, et al. Simvastatin prevents isoproterenol-induced cardiac hypertrophy through modulation of the JAK/STAT pathway [J]. Drug Des Devel Ther, 2015, 9: 3217-3229.

[7] Katare PB, Bagul PK, Dinda AK, et al. Toll-Like receptor 4 inhibition improves oxidative stress and mitochondrial health in isoproterenol-induced cardiac hypertrophy in rats [J]. Front Immunol, 2017, 22(8): 719.

[8] Suchal K, Malik S, Gamad N, et al. Kampeferol protects against oxidative stress and apoptotic damage in experimental model of isoproterenol-induced cardiac toxicity in rats [J]. Phytomedicine, 2016, 23(12): 1401-1408.

[9] Zhu XQ, Hong HS, Lin XH, et al. Changes in cardiac aldosterone and its synthase in rats with chronic heart failure: an intervention study of long-term treatment with recombinant human brain natriuretic peptide [J]. Braz J Med Biol Res, 2014, 47(8): 646-654.

[10] Shao Y, Redfors B, Scharin TM, et al. Novel rat model reveals important roles of beta-adrenoreceptors in stress-induced cardiomyopathy [J]. Int J Cardiol, 2013, 168(3): 1943-1950.

[11] Zaitone SA, Abo-Gresha NM. Rosuvastatin promotes angiogenesis and reverses isoproterenol-induced acute myocardial infarction in rats: role of iNOS and VEGF [J]. Eur J Pharmacol, 2012, 691(1-3): 134-142.

[12] Kuloglu T, Aydin S, Eren MN, et al. Irisin: A potentially candidate marker for myocardial infarction [J]. Peptides, 2014, 55: 85-91.

[13] Wallner M, Duran JM, Mohsin S, et al. Acute catecholamine exposure causes reversible myocyte injury without cardiac regeneration [J]. Circ Res, 2016, 119(7): 865-879.

[14] Shao Y, Redfors B, Ståhlman M, et al. A mouse model reveals an important role for catecholamine-induced lipotoxicity in the pathogenesis of stress-induced cardiomyopathy [J]. Eur J Heart Fail, 2013, 15(1): 9-22.

[15] Shukla SK, Sharma SB, Singh UR. β-Adrenoreceptor agonist isoproterenol alters oxidative status, inflammatory signaling, injury markers and apoptotic cell death in myocardium of rats [J]. Ind J Clin Biochem, 2015, 30(1): 27-34.

[16] Ojha S, Azimullah S, Mohanraj R, et al. Thymoquinone protects against myocardial ischemic injury by mitigating oxidative stress and inflammation [J]. Evid Based Complement Alternat Med, 2015, 2015: 143629.

[17] Xiao H, Li H, Wang JJ, et al. IL-18 cleavage triggers cardiac inflammation and fibrosis upon b-adrenergic insult [J]. Eur Heart J, 2018, 39(1): 60-69.

[18] Reddy NM, Mahajan UB, Patil CR, et al. Eplerenone attenuates cardiac dysfunction and oxidative stress in β-receptor stimulated myocardial infarcted rats [J]. Am J Transl Res, 2015, 7(9): 1602-1611.

[19] Derbali A, Mnafgui K, Affes M, et al. Cardioprotective effect of linseed oil against isoproterenol-induced myocardial infarction in Wistar rats: a biochemical and electrocardiographic study [J]. J Physiol Biochem, 2015, 71(2): 281-288.

[20] Shaik AH, Shaik NR, Mohammed AK, et al. Terminalia pallida fruit ethanolic extract ameliorates lipids, lipoproteins, lipid metabolism marker enzymes and paraoxonase in isoproterenol-induced myocardial infarcted rats [J]. Saudi J Biol Sci, 2018, 25(3): 431-436.

[21] Ni L, Zhou CQ, Duan QL, et al. β-AR blockers suppresses ER stress in cardiac hypertrophy and heart failure [J]. PLoS One, 2011, 6: 27294.

[22] Yang J, Wang Z, Chen DL. Shikonin ameliorates isoproterenol (ISO)-induced myocardial damage through suppressing fibrosis, inflammation, apoptosis and ER stress [J]. Biomed Pharmacother, 2017, 93: 1343-1357.

[23] Lu FH, Fu SB, Leng X, et al. Role of the calcium-sensing receptor in cardiomyocyte apoptosis via the sarcoplasmic reticulum and mitochondrial death pathway in cardiac hypertrophy and heart failure [J]. Cell Physiol Biochem, 2013, 31(4-5): 728-743.

[24] Zhuo XZ, Wu Y, Ni YJ, et al. Isoproterenol instigates cardiomyocyte apoptosis and heart failure via AMPK inactivation-mediated endoplasmic reticulum stress [J]. Apoptosis, 2013, 18(7): 800-810.

[25] Mizushima N. Methods for monitoring autophagy [J]. Int J Biochem Cell Biol, 2004, 36: 2491-2502.

[26] Dong RQ, Wang ZF, Zhao C, et al. Toll-like receptor 4 knockout protects against isoproterenol-induced cardiac fibrosis: the role of autophagy [J]. J Cardiovasc Pharmacol Ther, 2015, 20(1): 84-92.

[27] Lu J, Sun D, Liu Z, et al. SIRT6 suppresses isoproterenol-induced cardiac hypertrophy through activation of autophagy [J]. Transl Res, 2016, 172: 96-112.e6.

[28] Bhuiyan MS, Fukunaga K. Inhibition of HtrA2/Omi ameliorates heart dysfunction following ischemia/reperfusion injury in rat heart in vivo [J]. Eur J Pharmacol, 2007, 557(2-3): 168-177.

[29] Hsu PL, Su BC, Kuok QY, et al. Extracellular matrix protein CCN1 regulates cardiomyocyte apoptosis in mice with stress-induced cardiac injury [J]. Cardiovasc Res, 2013, 98(1): 64-72.

[30] Lin KH, Kuo WW, Shibu MA, et al. E2/ER β enhances calcineurin protein degradatoin and PI3K/Akt/MDM2 signal transduction to inhibibit ISO-induced myocardial cell apoptosis [J]. Int J Mol Sci, 2017, 18(4).