鲜切猕猴桃片冷藏过程中优势腐败细菌的分离鉴定

王虎玄, 代春吉, 孙宏民, 杨 辉

(陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021)

0 引言

猕猴桃，也称奇异果，是一种风味鲜美、品质鲜嫩的水果，其口感酸甜可口，营养丰富，同时又具有强化免疫系统，促进伤口愈合，降低胆固醇，清热降火、润燥通便等保健价值，因而被誉为“水果之王”，是老少皆宜的滋补果品[1].

猕猴桃原产于湖南省湘西地区，秦岭北麓的陕西关中，如周至、户县、眉县等，已成为中国猕猴桃资源最丰富的地区之一.近年来，随着人们生活水平的提高和生活习惯的改变，鲜切果蔬越来越受到消费者青睐[2].由于猕猴桃对人体的营养价值高，其制品在国内外市场供不应求，尤其是无污染、高品质的鲜切猕猴桃片颇受消费者欢迎[3,4].

然而，鲜切加工不可避免导致猕猴桃细胞受损，引起胞内汁液(内含丰富营养物质)外渗，从而为外界微生物的污染提供了温床，极易造成猕猴桃片在冷藏过程中腐烂变质，对产品质量安全和国内外贸易带来不利影响，也对猕猴桃加工产业的快速、健康发展造成弊端.研究表明，鲜切果蔬在冷藏期内的质量变化主要与产品褐变和微生物污染有关，但从整个冷藏期来看，微生物污染引起的腐败变质是主要因素[5,6].因此，对引起鲜切猕猴桃片在冷藏期内腐败变质的优势腐败菌进行分离鉴定具有实际应用价值.

相对一般果蔬制品而言，鲜切果蔬更容易被微生物污染继而导致变质，因而对引起其在冷藏过程中变质的相关腐败菌进行鉴别具有重要意义，可为鲜切果蔬冷藏过程中的微生物腐败进程和机制提供生物学证据，并为该类制品冷链流通中的品质检测、质量控制以及加工贮藏过程中的减菌和保鲜技术研究提供指导[6].近年来，关于鲜切果蔬制品保鲜技术的研究较多，主要集中于气调保鲜、涂膜保鲜、冷杀菌保鲜、生物保鲜技术等方面[7,8].已有研究人员对引起苹果、莲藕、辣椒、生菜等果蔬在鲜切加工、低温储存和冷链流通过程中变质的腐败菌进行了分离鉴定，但有关鲜切猕猴桃片冷藏过程中优势腐败菌的分离鉴定仍缺乏系统研究[9-11].

本研究以采购于陕西省周至县的海沃德猕猴桃(该品种是我国商业栽培面积最大的主栽品种)为原料，采用细菌培养基并通过稀释平板法对冷藏过程中变质猕猴桃片样品中的细菌进行分离纯化，观察单菌落和细胞形态，并基于16S rRNA基因测序进行菌种鉴定，然后将分离菌株接种于鲜切猕猴桃片，通过感官评定分析猕猴桃片品质变化，以验证分离菌株能够导致猕猴桃片腐败变质，为猕猴桃片鲜切加工中腐败细菌污染的有效控制提供理论依据和技术支撑.

1 材料与方法

1.1 样品与培养基

1.1.1 样品

新鲜猕猴桃，可溶性固形物含量为15.3±0.4%，pH值为3.5±0.1，采购于陕西省周至县.

1.1.2 培养基和主要试剂

平板计数琼脂培养基：胰蛋白胨5.0 g，酵母浸膏2.5 g，葡萄糖1.0 g，琼脂15.0 g，蒸馏水1 000 mL.

营养培养液：蛋白胨 10.0 g，牛肉膏 3.0 g，氯化钠 5.0 g，蒸馏水 1 L.

生理盐水：氯化钠 8.5 g，蒸馏水1 L.

细菌基因组DNA提取试剂盒(北京天根)，16S rRNA基因扩增引物(北京华大)，PCR试剂(Taq DNA 聚合酶、dNTP、缓冲液、MgCl2)(大连Takara)，Marker(大连Takara)，琼脂糖(美国Invitrogen).

其它试剂均为国产分析纯或生化试剂.

1.2 主要仪器与设备

JA2003型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)、DY-A型电泳仪(上海康达仪器厂)、CX31 型显微镜(奥林巴斯公司)、PTC-200型PCR仪(BIO-RAD公司)、HC-3018R型台式冷冻离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)、Gel Doc XR型凝胶成像仪(BIO-RAD公司).

1.3 试验方法

1.3.1 鲜切猕猴桃样品的制备

挑选无破损、无病虫害腐烂的猕猴桃用无菌水洗净，放于滤纸上沥干，去皮后再次用无菌水洗涤并用无菌滤纸沥干.用灭菌的解剖刀将猕猴桃切成均匀的薄片(厚度约为2～3 mm)，准确称量20 g，无菌自封袋密封后置于4 ℃下贮存.

1.3.2 可培养细菌总数的测定

每隔2 d取出冷藏的猕猴桃样品(3包)，无菌操作下各加入预先灭菌的生理盐水180 mL并充分混匀，制成1∶10样品悬液.取1 mL样品液用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释，参考《食品卫生微生物学检验 菌落总数测定》(GB/T4789.2-2016)中方法进行菌落(CFU/g)计数.

1.3.3 优势腐败细菌的分离纯化

按1.3.2方法用无菌生理盐水对已冷藏8 d的猕猴桃片样品进行梯度稀释，吸取合适稀释液涂平板，置于30 ℃下培养72 h，每个稀释度重复培养3次.选用大直径(15 cm)平皿以提高分辨率.根据菌落形态特征对菌落分组并计数，以数量最多的4～5组菌为优势菌，挑取单菌落进行反复平板划线纯化.纯化后的菌落在显微镜下观察纯度，不含杂菌后于斜面培养基上划线接种，36 ℃培养2 d后置于4 ℃保存.

1.3.4 单菌落及细胞形态观察

分离菌株在营养琼脂平板上划线接种，36 ℃培养2～4 d后进行单菌落形态观察.分离菌株在营养培养液中接种，光学显微镜下(10倍目镜，100倍物镜)观察对数生长期菌株细胞形态.

1.3.5 优势腐败细菌分子鉴定

各分离菌株在营养培养液中活化后，离心收集菌体.菌体总DNA提取方法参考试剂盒说明书进行.

采用通用引物27f:5-AGAGTTTGATC-CTGGCTCAG-3和1492r:5-ACGGCTACC-TTGTTACGACTT-3进行16S rDNA扩增.扩增体系：总体积50μL，包括2μL上游引物，2μL下游引物，25μL Taq PCR MasterMix，2μL模板DNA，19μL 灭菌超纯水[10].PCR反应程序：95 ℃/3 min(预变性)；95 ℃/45 s变性，56 ℃/45 s 退火，72 ℃/90 s 延伸，30个循环；72 ℃/10 min 延伸.扩增产物通过1.0% 琼脂糖凝胶电泳确认扩增是否成功，并委托西安生工技术有限公司对扩增产物序列进行测定.通过BLAST工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)对扩增产物序列与GenBank数据库中16S rDNA序列进行比对，并通过MEGA 6.0软件并采用NJ(Neighbour-joining)法进行系统发育树构建，确定分离菌株遗传地位[12].

1.3.6 优势腐败细菌污染对鲜切猕猴桃品质的影响

鲜切猕猴桃片样品的制备方法基本与1.3.1中的方法一致.不同之处在于猕猴桃切片后用75%的酒精浸泡一定时间，以避免杂菌污染对实验结果的干扰.张开自封袋口于无菌操作台中放置数分钟使酒精充分挥发，然后接种预先配制的菌悬液于猕猴桃片表面，混匀后密封，置于4 ℃下冷藏.参考GB/T 22474-2008《果酱》可知色泽、气味、滋味(考虑到安全性，不做评价)、杂质、组织状态是评价果片感官质量的重要指标，挑选8名具有一定感官评定经验人员组成评定小组(4男4女，19～32岁)， 对上述指标进行评价打分.各指标评价打分范围为0～10分，0分表示该指标强度偏弱，10分表示该指标强度偏强.每隔2 d取出冷藏的鲜切猕猴桃样品进行感官评定，记录评价结果.计算各指标值的平均值，然后进行分析.

2 结果与讨论

2.1 鲜切猕猴桃片冷藏过程中可培养细菌总数的变化

4 ℃条件下，鲜切猕猴桃片贮存12 d期间的可培养细菌总数变化规律如图1所示.从图1可以看出，冷藏条件下，猕猴桃片的可培养细菌总数总体上呈增长趋势，但在0～6 d，可培养细菌总数增长相对缓慢，这可能是外界条件变化导致的优胜略汰过程：样品中原有的一部分喜温菌无法耐受低温胁迫而死亡，而另一部分细菌需要调整新陈代谢途径以适应低温胁迫.适应期过后，耐低温细菌通过代谢猕猴桃片营养物质进行增殖，因而冷藏6 d后，可培养细菌总数呈现出指数增长的趋势.第8 d时增加至6.16±0.24 Lg CFU/g；冷藏至第12 d时，菌落总数已达到7.42±0.32 Lg CFU/g.一般认为，果蔬中总活菌数达到6.0 Lg CFU/g左右时就可以认为其开始腐败变质，日本最新发布的微生物管理标准认为新鲜果蔬中活菌数应控制在5.0 Lg CFU/g以下[13].因此，本文中的鲜切猕猴桃片样品4 ℃贮存8 d后开始腐败变质.

图1 鲜切猕猴桃片4 ℃冷藏过程中可培养细菌总数的变化

2.2 腐败细菌的分离及优势腐败细菌的特征

对4 ℃冷藏8 d后的猕猴桃片样品中的腐败细菌进行平板计数，可培养细菌平均菌落总数为237 CFU/平板；根据单菌落形态特征大致分为13组：菌株1～13.其中菌株1～4数量最多，确定为优势腐败细菌.

图2为菌株1～4的菌落及细胞形态特征.由图2可以看出，占菌落总数比例最大(30.80%)的菌株1的菌落大小适中，直径约为1.5～3.0 mm，圆形，白色，表明光滑，边缘整齐；显微镜下观察为球菌，排列整齐，大小较为一致.其次为菌株2，占菌落总数的18.14%，其菌落大小一致，圆形，米白色，表面光滑，边缘整齐，菌落直径大约为4.0～6.0 mm，菌苔较厚，中间凸起；显微镜下观察细胞形态不规则且大小不一，易成对或排列成短链状.菌株3占菌落总数的13.08%，其菌苔较薄，菌落大小差异较大(1.5～4.5 mm)，乳白色，表面光滑，边缘整齐；在显微镜下观察细胞形态不规则且大小不一，无规则排列.菌株4占菌落总数的8.86%，菌苔较厚，中间凸起，菌落为圆形，黄色，表面光滑，边缘整齐，大小较为一致，直径约为3.0～5.0 mm；显微镜下观察为球菌，单独或成双排列.

(a)菌株1的单菌落及细胞形态

(b)菌株2的单菌落及细胞形态

(c)菌株3的单菌落及细胞形态

(d)菌株4的单菌落及细胞形态图2 4株优势腐败细菌的单菌落和细胞形态

2.3 优势腐败细菌的菌种鉴定

由于具有高度的保守性与特异性，16S rDNA已被广泛应用于细菌的分类鉴定研究[14].结果表明：菌株1与沃氏葡萄球菌(Staphylococcuswarneri)的亲缘关系最近，同源率为99.51%；菌株2与巴氏葡萄球菌(Staphylococcuspasteuri)的亲缘关系最近，同源率为99.93%；菌株3和菌株4与葡萄球菌属菌株(Staphylococcussp.)的亲缘关系最近，同源率分别为99.43%和99.81% ，如表1所示；菌株1、菌株2分别与沃氏葡萄球菌(S.warneri)和巴氏葡萄球菌(S.pasteuri)聚成一类，表现出相同的系统发育地位；菌株3、菌株4均与葡萄球菌属菌株(S.sp)具有相同的系统发育地位，如图3所示.结合序列比对和系统发育分析，确定菌株1和2分别为沃氏葡萄球菌(S.warneri)和巴氏葡萄球菌(S.pasteuri)，菌株3和菌株4为葡萄球菌属菌株(S.sp).菌株3和菌株4通过16S rDNA仅鉴定到属，后期还需通过其它鉴定技术如随机扩增多态性DNA标记、微卫星序列测序等确定其种信息.

表1 分离菌株与Genbank参考菌株的比对结果

图3 分离菌株16S r DNA序列系统发育树

鲜切果蔬作为时尚健康食品越来越受到消费者青睐，但由于其在鲜切加工中导致组织细胞破损，细胞内含物外留(含丰富营养物质)，在鲜切加工环境卫生条件不达标的情况下，极易引起微生物污染.虽然低温冷藏可以抑制大部分污染微生物生长，但部分微生物如耐低温细菌能够通过新陈代谢途径调控来提高细胞抵抗低温胁迫能力，继而导致鲜切果蔬在低温贮存中腐败变质.目前已在鲜切果蔬中发现的污染细菌有李斯特菌、大肠杆菌O157：H7、志贺氏杆菌属、梭状芽孢杆菌、醋酸钙不动杆菌、克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、耶尔森菌属等，但本研究分离得到的沃氏葡萄球菌和巴氏葡萄球菌尚未有相关报道[15].

2.4 优势腐败细菌污染对鲜切猕猴桃品质的影响

通过回接实验研究优势腐败分离菌对猕猴桃片品质的影响，以验证四株分离菌腐败性.图4展示了冷藏条件下，接种猕猴桃片各感官评价指标值随冷藏时间延长的变化.从图4可以看出，四株分离菌污染对鲜切猕猴桃品质的影响基本一致，接菌后猕猴桃片果香较浓，没有发黄、腐臭、变软、液化等不良品质变化；冷藏2 d 后，猕猴桃片果香衰减，出现轻微发黄、腐臭、变软、褐变等不良变化；冷藏4 d后，猕猴桃片果香持续衰减，果籽附近颜色变深有轻微发黑，腐臭味加重，猕猴桃片软化加重，自封袋内出现液体水分；冷藏6 d后，样品果香味微弱，腐臭味持续加重，甚至刺鼻，果籽附近颜色发黑加重，自封袋内出现大量液体水分，并且液体较为浑浊；冷藏8～10 d后，样品果香味完全消失，散发刺鼻腐臭味，猕猴桃片发黄并软化严重，自封袋底部出现大量浑浊水分，已完全腐败变质.

(a)4 ℃冷藏下菌株1污染对猕猴桃片品质的影响

(b)4 ℃冷藏下菌株2污染对猕猴桃片品质的影响

(c)4 ℃冷藏下菌株3污染对猕猴桃片品质的影响

(d)4 ℃冷藏下菌株4污染对猕猴桃片品质的影响图4 分离菌株污染对猕猴桃片品质的影响

鲜切加工破坏了猕猴桃果实屏障，使果肉组织直接与外界环境接触，外界的一些不利因素如氧气、微生物污染等导致裸露组织发生变色(主要为褐变)、果实固有风味及果实营养损失、果片硬度降低等一系列影响果片品质的生理生化反应.猕猴桃鲜切加工中发生的褐变主要为酶促褐变，多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)是催化该反应的关键酶，果实中的酚类化合物在PPO的催化下与环境中氧气发生一系列反应，生成的醌类产物进一步发生聚合反应后形成黑色产物，导致果片颜色加深.已有报道指出在提前使用保鲜剂处理样品的条件下，果蔬在鲜切加工后也会发生褐变，并且随着储存时间的延长其褐变程度会逐渐加重[16].鲜切加工后，猕猴桃果实固有风味的损失主要是由于果实天然屏障(果皮)的去除以及冷藏过程中腐败菌新陈代谢活动，产生三甲胺、乙酸、硫化氢、乙硫醇等腐败臭味，导致鲜切猕猴桃原有果香味的衰减及腐臭味的加重[15].果片硬度降低主要是因为果片组织细胞壁在来源于腐败细菌代谢产生的胞壁降解酶作用下发生了降解，同时果肉组织细胞间质中的原果胶(不溶于水)发生水解反应，生成果胶(溶于水)，导致细胞间质软化，细胞相互分离，宏观上表现为果肉组织硬度降低；此外，失水和渗透性的改变是影响鲜切猕猴桃片硬度的另一个主要原因.鲜切果蔬的最大优势在于营养、美味、便捷，但因为鲜切加工损伤果肉组织细胞，导致营养物质丰富的细胞内容物外流，继而引发冷藏期间腐败微生物污染鲜切果蔬导致果肉组织细胞内发生系列生理生化反应，降低其营养价值.有报道指出鲜切苹果片有关营养价值的理化指标如总糖、可溶性固形物含量、Vc含量、可滴定酸含量等随着冷藏时间的延长逐渐降低[17].目前，为了供应高品质的新鲜产品，在鲜切果蔬产业中已广泛开展了杀菌防控技术研究，包括传统氯杀菌技术以及辐照杀菌、紫外先杀菌、等离子体杀菌、脉冲电场杀菌等代替氯的其他冷杀菌技术，为鲜切果蔬加工中腐败菌污染的控制提供了技术保障.

3 结论

鲜切果蔬冷藏期间其表面腐败细菌的种类及数量直接影响产品品质及货架期.本文结果表明，鲜切猕猴桃片在4 ℃冷藏过程中，可培养细菌总数随着冷藏时间延长逐渐增加，冷藏第8 d时达到6.16±0.24 Lg CFU/g，进入腐败初期，此后可培养细菌总数以指数形式增加，腐败加剧；冷藏过程中的优势腐败细菌主要为沃氏葡萄球菌(Staphylococcuswarneri)、巴氏葡萄球菌(Staphylococcuspasteuri)和葡萄球菌属(Staphylococcussp.)菌株；回接实验表明分离纯化的四株优势菌株均对鲜切猕猴桃片有腐败作用.上述结果为鲜切猕猴桃片冷藏过程中的腐败细菌污染进程和机制提供了生物学证据，上述腐败细菌也可成为鲜切猕猴桃片产品质量安全系统评价的潜在指标.