黄皮叶总黄酮的提取及鉴别

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(1.右江民族医学院 临床医学院，广西 百色533000；2. 右江民族医学院 药学院，百色533000；3.右江民族医学院 广西高校右江流域特色民族药研究重点实验室，广西 百色533000)

黄皮叶，别名油皮、油梅，来源于芸香科黄皮属植物黄皮[Clausenalansium(Lour.) Skeels]。黄皮是中国南方果品之一，盛产于广西、广东、云南、海南、福建、台湾等地[1]，在中国已有一千五百多年的历史，含丰富的果胶、维生素C、糖、有机酸及黄酮等成分[2]，以根、叶、果及种子入药[2-3]。黄皮叶味属苦、辛、平，有“解秽除垢，退黄肿”之功效，可用于治疗咳嗽哮喘、气胀腹痛、疟疾、温病身热、黄肿、热毒疥癞、小便不利等疾病，民间常用其煮水治疗感冒、胃痛、疝气、急性黄疸型肝炎、高血脂、牛臌胀、猪哮喘等病症[2-6]。黄皮叶中含有多种化合物，包括挥发油、香豆素、卡巴唑、黄皮酰胺及萜类等，其中，黄皮酰胺生物碱类物质能对抗衰老、提高记忆力、延缓老年痴呆，还具有解毒功能[2]。

目前针对黄皮叶的化学成分研究仍比较少，且较多集中在挥发油，其药理活性研究方面的文献报道也不多，生物活性作用物质基础不明确，导致其在临床上的应用受到限制。国内外对黄皮叶只是进行了一些基础的研究，对于其药理成分以及单一结构的药效分析文献报道较少，缺乏黄皮叶总黄酮提取工艺及鉴别的研究，限制了黄皮叶的进一步开发利用尤其总黄酮提取的工业化生产等问题，因此需要进一步探讨黄皮叶总黄酮的提取及鉴别，为新药的开发提供理论依据。黄皮叶作为中国南方的地道药材和优势资源，具有巨大的医药应用开发价值，本实验旨在探究黄皮叶总黄酮的提取及鉴别方法，为进一步开发和利用黄皮叶植物资源提供基础的科学依据，从而减少资源浪费。

1 材料与方法

1.1 材料

新鲜黄皮叶。 95%乙醇、亚硝酸钠AR、硝酸铝AR、氢氧化钠AR、正丁醇AR、氨水AR、氯化铝AR、乙酸镁AR、甲醇AR、镁粉AR、盐酸AR、冰醋酸AR、芦丁标准品(中国食品药品测定研究院)。DHG-9070A电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司、太仓精宏仪器设备有限公司)，TGL-15B高速离心器(上海安亭科学仪器厂)，N4S紫外可见分光光度计(上海仪电分析仪器有限公司)，ZF-2暗箱式紫外分析仪(北京凯蒂莱特仪器设备有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 工艺流程

黄皮叶总黄酮提取工艺流程见图1。

图1 黄皮叶总黄酮提取工艺流程

1.2.2 操作步骤

新鲜黄皮叶，晒干，切碎，取250 g置于T锅中，加蒸馏水煮沸3 h。冷却后进行粗滤，用上述方法对滤渣进行再次浸取，将两次滤液合并，离心(5 min，13 000 r·min-1)。然后进行蒸发浓缩(温度为85 ℃)。浓缩冷却后加入等体积95%乙醇，放入冰箱内2 h。再次离心(5 min，13 000 r·min-1)。过滤得滤液，弃去滤渣。对滤液进行蒸发浓缩(温度为85 ℃)。待乙醇蒸发完，将浓液置于电热恒温鼓风干燥箱中干燥成糖浆状，得到终成品。

1.3 定量实验─总黄酮的含量测定

1.3.1 标准曲线的制备

标准溶液的制备：精密称取芦丁对照品20 mg，置于50 mL容量瓶中，加入95%乙醇溶液并稀释至刻度，摇匀。精密量取25 mL置于50 ml容量瓶中，加入95%乙醇稀释至刻度，摇匀即得(每1 mL含有无水芦丁0.2 mg)。

标准曲线的制备：精密吸取对照溶液0.0，2.0，4.0，6.0，8.0，12.0 mL置于50 mL容量瓶中，各加95%乙醇12 mL，加5%亚硝酸钠溶液2.0 mL，混匀，放置6 min，再加10%硝酸铝溶液2.0 mL，混匀，放置6 min，加5%氢氧化钠溶液20 mL，最后用95%乙醇稀释至刻度，摇匀。以第1瓶为空白溶液，用N4S紫外可见分光光度计，在500 nm上测定吸光度。结果见表1。

表1 分光光度法测定吸光度结果

根据上表得一个回归方程：A=10.238 2C-0.021 3，r=0.999，n=5，其中截距-0.021 3,斜率10.238 2。

1.3.2 提取物含量的测定

精密称定提取物5.000 0 g，置于圆底烧瓶中，加95%乙醇回流萃取3 h，将提取液置于烧杯中，水浴加热浓缩至干，再用热水洗涤3次，将洗液移至分液漏斗中，并加入正丁醇液萃取3到5次，10 mL/次，合并萃取液于烧杯中，水浴蒸干，再加95%乙醇使其溶解，并移于50 mL容量瓶中，再加95%乙醇至刻度，摇匀，按标准曲线的制备操作测定吸光度，A=0.371。

1.3.3 颜色反应

紫外光下呈色反应：取该样品溶液滴在滤纸上，在可见光下呈淡黄色，在紫外光下呈淡蓝色并有荧光斑点。

浓氨水反应：取该样品溶液滴在滤纸上，将滤纸在氨水上方熏0.5 min，立即在紫外光下观察，呈黄褐色荧光斑点。

三氯化铝反应：取样品溶液滴在滤纸上，滴加1%氯化铝乙醇溶液，晾干，在可见光下呈灰黄色，在紫外光下呈黄色荧光斑点。

乙酸镁反应：取样品溶液滴在滤纸上，滴加1%乙酸镁甲醇溶液，晾干，在紫外光下呈黄色斑点。

盐酸-镁粉反应：取乙醇提取液1 mL于试管中加镁粉，再连续加入数滴浓盐酸，在泡沫处呈紫红色。

1.3.4 纸层析取

用毛细吸管吸取样品溶液在层析纸上画一条细线，用体积比正丁醇∶醋酸∶水=4∶1∶5为展开剂，上行展开1 h，取出晾干。喷1%氯化铝乙醇溶液。晾干后在紫外光下呈荧光斑点。

2 结 果

A=0.371，根据回归方程：A=10.238 2C-0.0213，计算样品中总黄酮的含量C=3.83%。回收实验：精密称提取物5.000 0 g，加入对照芦丁对照品40 mg，同前样品测定方法操作测定吸光度，求出回收率为89.98%。

3 结 论

黄酮类化合物(flavonoids compounds)，别名类黄酮，是一类存在于自然界中，由植物光合作用产生的、具有2-苯基色原酮(flavone)结构的化合物。它的药用价值很高，不仅可以促进植物生长发育，而且还具有镇痛、抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗癌、抗心脑血管疾病、抗辐射、抗氧化自由基、抗衰老、保肝以及免疫调节等方面的药理活性，可用于治疗骨质疏松症和糖尿病[7-9]。迄今为止，被鉴定出来的黄酮类化合物已有8 000多种[10]。目前，黄酮类化合物常作为风味剂、天然抗氧化剂、饲料添加剂、生长调节剂广泛地运用于食品工业和畜牧业，在医药工业中则被用来开发抗病毒、抗肿瘤、抗紫外剂以及治疗心脑血管疾病等功能性药物[11]。

1956年英国学者Denham Harman提出自由基学说，揭示自由基参与多种疾病的病理过程，细胞正常代谢产生的自由基攻击生命大分子，造成组织损伤和机体退行性变，加速细胞衰老，诱发肿瘤等恶性疾病[12]。而黄酮类化合物是自然界中抗氧化作用最强的一类天然化合物，由于它具有很强的抑制活性氧、清除自由基作用，同时毒副作用相对小于化学合成药，因此黄酮类化合物一直是人们致力于寻找新药的重要研究领域。

针对黄皮叶中黄酮类成分的研究还不够深入，缺乏对黄皮叶总黄酮的提取及鉴别这一问题，本实验采用纯物理的工艺流程提取黄皮叶总黄酮，为进一步研究黄皮叶总黄酮的工业化生产以及黄皮叶的质量控制和药理作用研究及其深入开发奠定基础。此外，本实验方法操作简单，回收率以及纯度较高，采用全物理过程,无任何化学变化及污染,且该方法操作简单方便,是一条理想的提取黄酮类物质的途径。