“三法三穴”推拿手法对坐骨神经损伤大鼠运动功能和脊髓NogoA及其受体表达的影响①

李易真，杨超，于天源，鲁梦倩，苗润培，吕桃桃

北京中医药大学，北京市100029

推拿能恢复周围神经损伤后造成的感觉及运动功能失常，并能促进损伤后周围神经修复和神经元存活[1-3]。周围神经损伤后，损伤平面以上出现轴突和神经元胞体变性甚至死亡[4]。髓磷脂抑制信号通路在神经再生中起重要作用，NogoA是重要的髓鞘相关蛋白，其活性位点Nogo-66能与其受体NgR结合，抑制神经元再生[5]。本研究观察坐骨神经损伤(sciatic nerve injury,SNI)大鼠脊髓内NogoA及受体NgR的表达，以及“三法三穴”推拿治疗的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性Sprague-Dawley大鼠64只，体质量(200±10)g，购自北京斯贝福实验动物技术有限公司，许可证号SCXK(京)2016-0011。适应性饲养1周。

所有实验程序均符合动物福利与伦理原则，并经北京中医药大学动物使用和管理委员会批准。

1.2 主要仪器与试剂

按摩推拿手法模拟仪：中国专利200710187403.1。Mini-P-2电泳槽、电泳仪：美国BIO-RAD公司。Fresco低温冷冻离心机、MultiSkan3酶标仪：美国THERMO公司。水平脱色摇床：北京六一生物科技有限公司。电动组织匀浆器：美国FLUKA公司。

BCA蛋白定量试剂盒、2 mg/ml BSA标准品、10×TBST(pH=8.0)、彩虹245广谱蛋白Marker(12条带)：北京索莱宝科技有限公司。水合氯醛：沪试公司。兔源NgR抗体、兔源NogoA抗体：英国ABCAM公司。

1.3 方法

随机数字表法将大鼠分为正常组、假手术组、模型组和推拿组各16只。

模型组和推拿组大鼠10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉，俯卧位固定于消毒过的鼠板上，右侧臀股交界处备皮、常规消毒，沿坐骨神经走行剪长约1 cm切口，钝性逐层分离肌肉，暴露梨状肌下缘及坐骨神经；弯钩镊确认坐骨神经后，用无齿10号持针器在距梨状肌下缘5 mm处满扣夹持坐骨神经5 s。逐层缝合，碘伏消毒。

假手术组同法显露坐骨神经，但不做夹持。正常组不手术。

各组于造模术后7 d开始干预。推拿组束缚后，使用手法模拟仪依次刺激大鼠右侧殷门、承山和阳陵泉[6]；模拟点法、拨法、揉法，力量4 N。每穴每法1 min，30次/min，共9 min。每天1次，治疗7次休息1 d。

正常组、假手术组和模型组同法抓取，不作干预。

按摩推拿手法模拟仪主要由步进电机、圆盘、压力传感器和接触点等组成，压力传感器和接触点通过金属条连接，使用导螺杆调节压力。压力大小显示在屏幕上。接触点是直径10 mm的圆形光滑接触面。

1.4 检测方法

于术后7 d干预前及干预20 d时，每组取8只大鼠进行检测。

1.4.1 斜板测试

斜板由两块矩形构成，表面铺厚约6 mm的橡胶垫，斜面角度可测。在室温、安静状态下，将大鼠头向前，身体纵轴与斜板纵轴平行放置，逐渐抬高斜板，记录大鼠能停留5 s而不跌落的最大角度。每只大鼠测量3次，取平均值。

1.4.2 Western blotting

大鼠斜板测试后，腹主动脉取血处死，迅速置于冰盘上，取L4-6节段脊髓，液氮冷冻，转移至-80℃冰箱中保存备用。

每组选6个样本组织，加入预冷RIPA裂解液3 ml充分研磨，12,000 r/min、4℃离心15 min，取上清液。BCA法测定蛋白浓度，取蛋白约10μg，加5倍SDS-PAGE上样缓冲液。80 V电泳20 min，100 V电泳60 min。120 V转膜120 min。加5%脱脂牛奶封闭60 min，1×TBST 10 min洗1次，共3次。将PVDF膜按蛋白分子量剪开，分别加入NogoA一抗(1∶1000)、NgR 一抗(1∶1000)和内参 β-actin 一抗(1∶3000)，摇床室温孵育60 min，4℃过夜。1×TBST 10 min洗1次，共3次。加HRP-羊抗兔IgG二抗(1∶3000)，室温摇床孵育60 min。1×TBST 10 min洗1次，共3次。ECL显影，自然晾干后封存。应用Quantity One软件计算目标条带积分光密度(integrated optical density,IOD)。

1.5 统计学分析

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。所有数据均符合正态分布，以(±s)表示。组间比较采用单因素方差分析，方差均齐，采用LSD t检验。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 斜板测试

术后7 d，模型组与推拿组大鼠斜板测试评分低于正常组(P<0.05)和假手术组；干预20 d时，推拿组大鼠斜板测试评分低于正常组(P<0.05)，高于模型组(P<0.05)。见表1。

表1 各组不同时间点斜板测试结果(°)

2.2 Western blotting

术后7 d时，模型组和推拿组NogoA表达与正常组无显著性差异(P>0.05)；干预20 d时，推拿组和模型组NogoA表达水平虽有升高趋势，但仍无显著性差异(P>0.05)，推拿组和模型组之间也无显著性差异(P>0.05)。见图1、表2。

术后7 d时，模型组和推拿组NgR表达较正常组升高(P<0.05)；干预20 d时，推拿组NgR表达较模型组降低(P<0.05)，与正常组无显著性差异(P>0.05)。见图2、表3。

图1 各组NogoA蛋白表达(Western blotting)

表2 各组不同时间点NogoA蛋白表达(IOD)

图2 各组NgRA蛋白表达(Western blotting)

表3 各组不同时间点NgR蛋白表达(IOD)

3 讨论

本研究选取的穴位殷门、承山和阳陵泉，属“穴位-神经-肌肉相关区域”。此三穴为足太阳膀胱经和足少阳胆经所过，符合针灸学循经取穴及局部取穴的原则。从解剖学角度分析，殷门位于坐骨神经干处，承山和阳陵泉分别位于坐骨神经分支胫神经和腓总神经上。三穴周围为股二头肌、腓肠肌、胫前肌，是能够同时刺激穴位、神经和肌肉的最佳点。

周围神经通过神经元将信息沿感觉和运动纤维传递，参与躯体与内脏运动、感觉和自主功能调节[7]。神经损伤后，损伤段的近、远端将出现一系列病理、生理变化，神经元胞体、轴突、髓鞘、末梢感受器均会发生改变，从而发生感觉、运动功能障碍[8]。脊髓神经元支配周围神经感觉和运动功能，当神经纤维受损后，支配该部分的脊髓神经元和轴突也会受损变性，影响神经功能。修复脊髓神经元和轴突，是恢复周围神经功能的重要一环。

在中枢神经系统髓鞘中，有3种主要影响神经元轴突再生和修复的髓鞘相关抑制因子，分别是Nogo蛋白、髓鞘相关糖蛋白(myelin-associated glycoprotein,MAG)和少突胶质细胞髓鞘糖蛋白(oligoden-drocyte myelin glycoprotein,OMgp)[9-10]，这3种蛋白通过与其受体蛋白结合，形成信号通路，发挥抑制作用。

髓鞘相关抑制因子中以Nogo蛋白作用最为突出。NogoA的羧基端亲水结构域Nogo-66是发挥抑制作用的主要部分。Fournier等[11]利用碱性磷酸酶融合技术发现与NogoA结合的受体结构NgR。NgR和Nogo-66有高度亲和力，两者结合形成信号通路，传导抑制信号，作用于轴突细胞，诱导细胞生长锥坍塌，抑制轴突细胞的生长。抑制NgR1的表达可有效促进神经元轴突再生[12]。Liu等[13]发现，NgR不仅能与NogoA结合，还能与MAG和OMgp形成复合体，发挥同样的轴突抑制作用。

NgR属糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白，具有多个富含亮氨酸的重复结构[14]。NgR需与神经营养因子p75(p75NTR)受体[15]和一种特异性定位于神经系统的蛋白质Lingo-1[16]特异性结合，共同介导轴突抑制作用。NogoA作用于神经元时，首先与该神经元胞膜蛋白中的NgR、p75NTR、Lingo-1结合，形成复合物，激活下游信号分子。

NgR是3种髓鞘抑制因子共同作用的靶点。使用NgR拮抗剂阻断NogoA、MAG和OMgp与NgR的结合，是目前治疗脊髓神经元损伤的常用途径和研究热点[17]。Gou等[18]发现，NgR1拮抗剂TAT-NEP1-40可对神经元提供保护作用，降低脑梗死容积，促进模型动物神经系统修复。Cao等[19]发现，NgR拮抗剂NEP1-40能促进侧索损伤大鼠功能恢复和轴突再生。李鹏等[20]发现，新型NgR拮抗剂A3NEP1-40能促进周围神经损伤处轴突的延伸，促进大鼠SNI后后肢运动功能恢复。

本研究显示，推拿干预20 d后，能促进SNI大鼠患侧肢体运动功能恢复。

本研究显示，SNI大鼠L3-5脊髓内NogoA蛋白变化不明显。闵友江等[21]对脊髓损伤大鼠NogoA蛋白不同时相的表达进行检测，发现术后21 d时，NogoA含量达到峰值。周围神经损伤后大鼠脊髓中NogoA的时相变化没有检索到相关文献，需要进一步研究。推拿干预20 d后，大鼠NogoA蛋白有升高趋势，与模型组相似，表明推拿对NogoA蛋白的抑制作用不明显。李小琴等[22]发现，电针能抑制MAG蛋白表达，促进轴突再生，促进大鼠运动功能恢复。

本研究显示，SNI大鼠L3-5脊髓内NgR蛋白表达增高，可能与轴突逆行性损伤导致抑制通路激活有关。SNI后，损伤平面以上的神经元轴突也出现损伤，引起髓磷脂抑制因子表达增高，NgR表达升高，发挥轴突抑制作用。推拿干预20 d后，NgR蛋白降低，可能是推拿发挥治疗作用的机制之一。

前期研究显示，推拿殷门、承山、阳陵泉可显著改善大鼠感觉及运动功能，上调神经生长因子、神经丝蛋白等，保护神经纤维超微结构，促进神经功能恢复[23-25]。Pan等[26]研究显示，推拿能调节损伤点远端组织型纤溶酶原激活物与纤溶酶原激活物抑制剂的稳态，维持微环境修复能力，使其趋近于正常状态，预防和解除胶原纤维形成结缔组织瘢痕，为突触重塑提供良好环境。推拿通过降低SNI大鼠脊髓中MAG和Rho相关激酶2的表达，抑制微管与神经丝解聚，维护神经元细胞骨架结构的稳定[27]。

NogoA通过与NgR结合发挥轴突抑制作用。推拿可降低脊髓中NgR蛋白表达，促进轴突再生，起到类似NgR拮抗剂的作用。其机理可能包括抑制Ca2+内流、稳定神经递质浓度、上调神经营养因子分泌等多种途径，有待进一步研究。

综上所述，推拿手法可通过降低SNI后NgR蛋白在相应节段脊髓内的表达，阻断轴突抑制通路的激活，保护神经元，进而促进轴突再生，最终改善SNI大鼠运动功能。