间充质干细胞旁分泌作用在心血管疾病治疗中的研究进展

公绪合综述，王国干审校

间充质干细胞（MSC）治疗心血管疾病取得很大进展，然而具体机制不明，早期认为是干细胞分化参与了治疗过程，然而直接分化的证据不足，且分化作用不能解释干细胞治疗的早期获益，比如Gnecchi等[1]研究发现干细胞移植后72 h就可获得心功能改善；同时MSC条件培养基在体外也可以促进缺血心肌的修复[2]。越来越多的研究者认识到MSC旁分泌作用的重要性。旁分泌作用是指干细胞自身分泌的各种因子参与心血管疾病的修复和治疗，此概念首先在心肌梗死的小鼠模型提出；研究者发现，骨髓MSC移植可缩小心肌梗死面积，改善心功能，然而移植心肌部位没有发现分化的心肌细胞，且静脉注射的MSC大多数停留在肺部和肝脏，只有很少部分到达心肌病理组织[3]。上述研究均提示，干细胞是通过旁分泌机制在心血管疾病治疗中发挥作用，这些旁分泌因子具有抗炎、抗凋亡、促进血管新生和修复等作用。下文以MSC旁分泌作用机制为线索，重点阐述其在心血管疾病治疗中的研究进展。

1 间充质干细胞旁分泌作用与心肌保护

心肌缺血环境中干细胞旁分泌作用的瞬时效应是分泌保护性的细胞因子来改善心肌细胞生存。Gnecchi等[1]研究发现，MSC依赖旁分泌机制发挥直接心肌保护作用，缺氧预处理的MSC条件培养基可以减少缺氧诱导的大鼠心肌细胞凋亡和坏死；该研究组还将MSC条件培养基注射到大鼠心肌梗死后心肌组织，结果72 h后，大鼠心肌梗死面积缩小，心肌细胞凋亡减少，其中注射蛋白激酶B修饰的间充质干细胞（Akt-MSC）条件培养基的大鼠改善最为明显。他们的研究证实，MSC通过释放旁分泌因子发挥心肌细胞保护作用，而蛋白激酶B（Akt）通路激活进一步刺激旁分泌因子的产生。

Uemura等[4]采用不同的检测方法，同样证实了MSC旁分泌作用对缺血心肌细胞的保护作用。他们发现，MSC条件培养基尤其是缺氧预处理的条件培养基高表达血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）和基质细胞衍生因子-1（SDF-1）；进一步体内实验将绿色荧光蛋白（GFP）标记的MSC移植到梗死心肌，发现梗死边缘有MSC，但GFP阳性的心肌细胞很少，分化机制无法解释干细胞移植缩小心肌梗死面积和改善心肌细胞凋亡的作用，因此推断MSC旁分泌机制起主要作用。

2 间充质干细胞旁分泌作用与血管新生

MSC旁分泌作用的另一个体现是促进血管新生。尽管许多研究显示骨髓来源干细胞可融合分化为血管结构，但仅少量血管组织含有寄主来源细胞。而旁分泌因子包括VEGF、bFGF和肝细胞生长因子-1（HGF-1）等可以促进内皮细胞和血管平滑肌细胞增殖、迁移和细胞外基质合成。Kamihata等[5]注射MSC至猪心肌梗死后缺血心肌区域，3周时该部位毛细血管密度增加、侧支血流明显灌注，移植干细胞表达bFGF、VEGF、血管生成素1（Ang-1），肿瘤坏死因子-α（TNF-α），白细胞介素（IL）1β等促生长因子；这种旁分泌因子促进血管新生的机制进一步被MSC条件培养基证实：仅注射MSC条件培养基至心肌缺血区域同样可以提高局部微血管密度。

许多研究证实，MSC条件培养基通过旁分泌机制促进侧支血管生成，旁分泌因子变化参与其中。Yin等[6]发现，脐带MSC条件培养基可促进内皮细胞、平滑肌细胞增殖和迁移，促进树鼩下肢血管新生，从而减轻肢体缺血。心肌梗死方面，MSC移植实验发现，尽管梗死心肌组织极少有寄主来源的新生内皮细胞，但局部毛细血管密度明显增加[7]。

上述研究表明，干细胞旁分泌作用极有可能参与了血管新生，旁分泌因子在缺血、缺氧后心肌组织毛细血管密度增加和血管新生等方面发挥重要作用。

3 间充质干细胞的重要旁分泌因子

MSC分泌多种旁分泌生物活性因子，包括抗凋亡、抗炎、趋化和再生因子等，例如VEGF、HGF-1和转化生长因子β（TGF-β）。

3.1 VEGF

VEGF是第一个被发现的可溶性血管刺激因子，多种组织均可产生这种血管内皮生长因子。研究证实，阻断VEGF表达可以治疗多种血管增生性疾病，如血管瘤和湿性黄斑变性[8-9]。相反，动物实验和临床研究显示，给予VEGF可以促进血管再生[10]。MSC表达VEGF与生理变化密切相关，是一种有效促进血管新生的方法。

在骨髓干细胞治疗缺血性心肌病心力衰竭动物的研究中，研究人员发现了VEGF在MSC调节血管新生中的作用，干细胞表达VEGF或VEGF联合干细胞移植能够更好地促进血管再生和内皮细胞增殖[11]。最新动物实验显示，MSC胞外囊泡通过激活VEGF受体，可促进小鼠后肢缺血的恢复[12]。临床试验干细胞治疗的获益则与血清VEGF升高相关[13]。

3.2 HGF-1

HGF-1是一种肝脏再生相关的基因转录因子，与酪氨酸激酶受体高度亲和，可激活一系列的再生活动，包括血管生成、肌肉生成和造血等。

HGF-1在多种干细胞治疗中起重要作用，比如HGF转染的MSC能够在肝脏损害中发挥保护作用[14]；Zhang等[15]将MSC或HGF-MSC移植到猪梗死后心肌组织中，4周后HGF-MSC移植猪的心肌血管密度和缝隙连接蛋白43（CX43）表达均增加，心肌细胞凋亡和室性心律失常减少。近年研究发现，MSC分泌HGF能够通过细胞外调节蛋白激酶（ERK1/2）调节单核细胞免疫反应，如增加IL-10产生[16]。综上，MSC分泌的HGF-1可发挥多种作用，包括血管再生、免疫调节和抗细胞凋亡。

3.3 TGF-β

多种组织来源的MSC均可分泌TGF-β，包括脂肪、骨髓和脐带。研究显示，干细胞分泌TGF-β可以抑制T细胞增殖，TGF-β在阻断MSC免疫抑制功能中发挥独特作用[17]；动物实验进一步证实，干细胞移植可促进脑缺血小鼠神经功能恢复，这种作用在沉默TGF-β之后消失，TGF-β依赖性的治疗作用与降低炎症反应和抑制小胶质细胞的活化有关[18]。

研究证实，TGF-β介导MSC的免疫调节和细胞分化作用；在MSC分化为成骨细胞、软骨细胞、成肌细胞、脂肪细胞的过程中，TGF-β发挥重要的调节作用；反之，TGF-β信号家族的突变可以通过影响MSC分化而诱导人体出现各种疾病[19]。

综上，MSC分泌TGF-β的作用与免疫调节、细胞分化密切相关，鉴于TGF-β在各种病理状态下对纤维化的作用，它在干细胞治疗研究中也将成为热点。

4 间充质干细胞旁分泌效应的刺激因素

4.1 缺氧预处理

组织缺氧后可产生缺氧诱导因子-1（HIF-1），进一步诱导血管原性基因如VEGF、SDF-1转录[20-21]，一旦MSC迁移至缺氧区域，各种旁分泌因子的表达明显增加。体外研究证实了缺氧与MSC旁分泌因子产生的关系，如骨髓MSC缺氧24 h后，VEGF、成纤维生长因子-2（FGF-2）、HGF、IGF-1的表达明显增加。缺氧不仅可促使骨髓来源MSC旁分泌因子增加，对脂肪[22]、胎盘[23]、牙髓[24]来源MSC有同样的效果；进一步研究显示，缺氧可刺激老年动物来源的MSC产生血管原性因子和抗凋亡因子，如VEGF、HGF、IGF-1等。近期研究发现，缺氧预处理能够通过HIF-1α-GRP78-Akt轴增强MSC的生物活性，包括增殖和分泌功能[25]。

缺氧不仅可刺激MSC旁分泌因子产生，而且可以维持MSC未分化的自我更新状态，这可能与MSC本身往往来源于缺氧组织有关，如脂肪、骨髓等[26]。另外，MSC治疗的一个关键作用就是抗炎和免疫调节，这种作用在移植物抗寄主病研究中被广泛证实，而缺氧预处理本身可以增强这种免疫调节活性。总之，缺氧预处理能够促进MSC旁分泌因子产生，促进血管生成及增强免疫调节活性。

4.2 炎症反应

除了缺氧刺激，炎症反应同样可以促进免疫调节和血管再生，干扰素-γ（IFN-γ）干预可诱导MSC产生炎症抑制因子，包括补体抑制因子H、免疫调节因子TGF-β 和HGF[27]。Noone等[28]的研究显示，IFN-γ干预的MSC通过上调前列腺素-2而免受自然杀伤细胞介导的杀伤。

TNF-α同样可以诱导增强MSC的再生活性。体外及体内下肢缺血动物实验显示，TNF-α处理的骨髓MSC具有更好的血管再生能力，可刺激VEGF高表达[29]。Lu等[30]的研究显示，TNF-α预处理可促使MSC增殖、迁移和成骨分化，上调骨形成蛋白-2（BMP-2），而通过沉默核糖核酸（RNA）方法干扰BMP-2表达则可部分抑制TNF-α诱导的成骨分化。近期研究显示，免疫催化剂如脂多糖、Toll样受体激动剂也可以通过诱导MSC旁分泌因子如VEGF的产生来促进血管新生[31]。总之，炎症刺激可增强MSC的再生潜能和抗炎能力。

4.3 基因联合治疗

基因联合MSC治疗，一方面通过转基因提高干细胞生存、代谢、增殖和分化，治疗作用大大增加，其中Akt-MSC模型就是一个典型例子；另一方面，干细胞可作为基因治疗的载体，分泌基因产物发挥自分泌和旁分泌作用而达到优化治疗。研究表明，Akt-1转染的MSC移植后存活率及功能更佳，可以释放更多的旁分泌因子，保护大鼠心肌细胞[32]。Zhou等[33]同样发现，B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）修饰MSC可提高大鼠心肌梗死细胞移植后干细胞存活率，促使更多的VEGF表达，增加毛细血管密度和减少心肌梗死面积。

以上研究说明，基因联合干细胞治疗可增强干细胞活力，促进更多的旁分泌因子产生，从而对临近心肌细胞产生有益作用。类似的HGF、bFGF、VEGF修饰的MSC同样具有较高的存活率，有心脏保护和血管新生作用。

4.4 三维立体培养

MSC常规在细胞塑料培养瓶中单层生长，三维立体如球状体培养可以产生更多的旁分泌因子，如三维立体培养的脐带MSC表型特征发生变化，可提高Toll样受体和趋化因子受体4（CXCR4）的表达水平，且其迁移和归巢能力增强[34]。Ylöstalo等[35]也发现，三维培养的MSC可分泌更多的抗炎、抗凋亡因子，如斯钙素1（STC-1）、CXCR4。三维培养的MSC条件培养基还可抑制TNF-α、趋化因子受体2（CXCL2）、IL-6、IL-12和IL-23的表达，通过半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）依赖的IL-1通路介导抗炎和免疫调节作用[36]；进一步研究证明，MSC往往自我聚集产生更多的旁分泌因子[37]。综上，MSC的旁分泌作用可以通过三维立体培养诱导增强。

5 间充质干细胞旁分泌作用的治疗前景

许多基础实验和临床研究均证实MSC治疗心血管疾病有获益，尤其是利用干细胞旁分泌作用治疗心肌梗死的研究最为深入，目前由于具体获益的旁分泌因子仍未完全明确，干细胞移植仍然是主流方法。若能明确有心脏益处的具体旁分泌因子以及最佳旁分泌因子移植途径（静脉、冠状动脉、心肌）、剂量、时间，则旁分泌因子移植更容易应用于临床实践。另外，人和动物模型的实质性差异使得问题更加复杂。单一剂量的生长因子能够促进动物血管新生，但在人体中则可能无效；另外，旁分泌因子的不稳定性和代谢学特点也是旁分泌因子移植治疗的巨大障碍之一。

虽然干细胞旁分泌治疗的道路充满困难，但随着研究的深入和蛋白技术的发展，相信未来会产生新的干细胞旁分泌治疗模式；在这种情况下，单一的干细胞旁分泌因子，或者更好的“鸡尾酒”旁分泌因子治疗心血管病将可能成为现实。