苜蓿青贮过程中叶绿素降解代谢研究进展

靳思玉，李苗苗，曹 阳

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆 163319）

青贮的色泽评分是感官评定青贮发酵品质的重要指标之一。通过青贮色泽可以评定牧草青贮的发酵品质。发酵品质良好的牧草青贮具有与新鲜牧草非常接近的颜色，若青贮前牧草为绿色，则青贮后仍然保持或接近绿色、黄绿色。研究表明，牧草青贮在发酵过程中如果可溶性糖转化成乳酸，即乳酸发酵则气味芳香、颜色鲜绿，如果可溶性糖转化成丁酸，即丁酸发酵则气味酸臭、颜色倾向于暗绿或黑绿色。青贮饲料保持与新鲜苜蓿相似颜色的程度，主要由苜蓿枝叶内叶绿素（Chl）的含量决定。

1 叶绿素的稳定性和功能

叶绿素主要由螯合一个镁离子的卟啉环和一个脂肪烃侧链的植基或称之为叶绿醇基（Phytol）两部分组成（陈俊毅等，2014）。苜蓿等植物茎叶内的Chl主要包括叶绿素a和叶绿素b（Matile等，1996），它们的化学结构高度相似，只有吡咯环Ⅱ上的附加基团存在差异，分别是甲基（-CH3）和甲醛基（-CHO）。叶绿素分子的这种特定结构如果能够在青贮过程中不被破坏，或者它的相关降解产物的结构不被破坏，那么高品质的青绿苜蓿青贮就应该具有苜蓿原料的鲜绿感官 （Playne等，2010；Bureenok 等，2005）。

1.1 叶绿素的稳定性 Chl分子通常很不稳定，在光、酸、碱、氧、氧化剂等条件下都会使其分解（Hendry 等，1987）。 King 等（2012）的研究揭示了不同植物的品种和收割阶段也是影响植物色素以及其他化学成分的重要因素。此外，植物色素如Chl、β-胡萝卜素等在紫外线、高温条件下大部分会分解。苜蓿饲料收割后，在自然干燥后，大部分色素也会被分解。苜蓿等粗饲料中富含Chl等光合色素成分，其中Chl或叶绿醇基的含量受到植物品种、栽培技术、施肥以及贮藏等生产条件的影响 （Sarmadi 等 ，2016；Van 等 ，2009；Nozière 等 ，2006）。尤其在酸性条件下，Chl分子很容易失去卟啉环中的镁成为去镁 Chl（Koca等，2006）。

1.2 叶绿素的功能 Chl及其衍生物有造血、提供维生素、解毒、抗病和抗氧化等功能，例如叶黄素是视网膜组成成分（Chew 等，1996），β-胡萝卜素是维生素E的合成原料（Brown等，1993），它们都具有提高免疫的功能，对动物机体具有积极作用（Büchert等，2011；Fukasawa 等，2010）。 Chl在瘤胃内通过生物氢化作用，叶绿醇会以游离态存在，叶绿醇再经过瘤胃微生物作用会生成植烷酸（Giron 等，2013；Abidi等，2013），这些植烷酸会随着代谢沉积到牛奶和牛肉中。植烷酸具有调节胰岛素和促进脂肪酸酸化作用 （Giron等，2013；David等，2013），对人类脂肪肝和糖尿病等具有缓解作用（林夏菁等，2012）。自上世纪90年代，消费者更加关注有机或功能性食品，如功能性牛奶（Bourn等，2002）。在奶制品中脂肪酸、类胡萝卜素、脂溶性维生素的含量被认定为标记指标，通过这些数据可以准确地反映出动物管理水平和奶制品品质（Bourn等，2002）。有研究报道，在饲喂高Chl含量的饲料后，牛奶中植烷酸含量偏高（Markus等，2012）。由于植烷酸不仅是机体氧化代谢的重要能量来源，而且在糖脂代谢、脂肪细胞分化聚酯调控方面具有特殊的生物学功能，所以，对泌乳后期的乳牛饲喂高Chl或者叶绿醇含量的茎叶饲料，可以防止乳牛肥胖，在分娩前后可以有效抑制脂肪肝的发生。

植烷酸不能在哺乳动物体内合成 （Allen等，2008），在人类血浆中植烷酸浓度为0.04～11.5μmol/L（Brown等，1993），它们几乎全部来自反刍动物产品，也就是说草食动物中只有牛、羊等反刍动物产品是植烷酸唯一来源（Allen等，2008）。因此，调制高品质的苜蓿青贮，不但可以减少饲料一般营养成分的损失，而且有效地保存苜蓿饲料中功能性成分Chl，并通过草食动物体内消化代谢，将更多的植烷酸沉积到牛奶和牛肉中，生产具有功能性的动物产品。

2 叶绿素国内外研究现状

2.1 叶片衰老过程中叶绿素降解途径 沈成国等（1998）在植物叶片衰老过程中叶绿素降解代谢的研究中表明，植物叶片叶绿素在自然环境中降解途径有三步：第一步，叶绿素酶（Chlase）作用下Chl脱植基反应；第二步，脱镁螯合酶（MDCase）作用下脱植基叶绿酸向脱镁叶绿素酸a转化；第三步，在脱镁叶绿素酸双氧酶（Pheide Dioxygenase）或者称为脱镁叶绿酸a单加氧酶（PAO）作用下卟啉环氧化开环反应。其中，由于卟啉环氧化开环反应与叶片的绿色褪去有关，因此第三步被认为是叶片衰老时叶色发黄的关键步骤。然而，Hrtensteinera（2006）经过进一步研究表明，叶绿素的降解代谢可以分为二个阶段：第一个阶段首先是叶绿素酶催化叶绿素（CLH）形成脱植基叶绿素，然后有一个金属螯合物脱去镁离子形成脱镁叶绿酸a（Pheidea），脱镁叶绿酸a经过由脱镁叶绿酸a加氧酶（PAO）和红色叶绿素代谢产物还原酶（PCCR）催化的两部反应转化成初生荧光叶绿素代谢产物（PFCC）；第二个阶段是PFCC经过异构化形成非荧光叶绿素代谢产物（NCCs），最后转化成单吡咯降解产物。Matile等（1999）认为叶绿素降解代谢的第一步是叶绿素在CLH的催化下生成脱植基叶绿素和植醇。然而，Schelbert等 （2009）发现，脱镁叶绿素酶（PPH），这个酶能够使脱镁叶绿素水解成脱镁叶绿酸。因此，叶绿素可以不经过CLH的脱脂基作用，而是首先失去镁离子，然后在PPH的作用下生成脱镁叶绿酸，之后反应继续下去，使绿色植物的茎叶绿色消失。

2.2 青贮苜蓿中的叶绿素 当前多数研究集中在绿色植物在衰老、风干、蒸煮、自然褪色，或者保鲜贮藏过程中叶绿素的降解代谢，并且其研究方向也多集中于植物学和植物生理学等相关领域。然而在饲料学、动物营养学领域中，关于叶绿素代谢以及在饲料上的应用方面尚是初步阶段；尤其在苜蓿青贮调制加工研究领域，尽管青贮苜蓿是用于反刍动物的重要的饲料之一 （Wilkinson等，2005），然而关于牧草青贮过程中叶绿素代谢方面的研究较少。Bruhn等（1978）对苜蓿在干燥贮藏过程对β-胡萝卜素含量影响进行了研究。Lindqvist等（2012）研究了风干或青贮对豆荚和牧草混合物中β-胡萝卜素含量的影响。虽然Koca等（2006）研究表明，在酸性条件下Chl分子很容易失去卟啉环中的镁成为去镁Chl而使植物叶片发生严重褪色，但我们的研究发现，发酵品质优良的苜蓿青贮色泽仍然接近新鲜的苜蓿，同时我们发现一些苜蓿青贮中叶绿素某些代谢产物如叶绿醇的摩尔数高于Chl，然而却没能检测到Chl酸脂和游离态植烷醇，那么苜蓿青贮中的Chl究竟会如何进行降解代谢呢？为了科学地解开这一系列谜团，研究苜蓿青贮过程中叶绿素代谢规律迫在眉睫。

2.3 叶绿素降解相关基因表达 目前关于苜蓿青贮过程中叶绿素降解相关基因的研究鲜见报道。但有关蔬菜保鲜过程中叶绿素降解相关基因表达变化的研究比较多。Agustin等 （2011）和Costa等（2006）分别报道了与蔬菜叶绿素降解相关基因 BoCLH1、BoCLH2、BoPPH、BoPaO、BoRC-CR 等的表达。 Gómez-Lobato等（2012）的研究表明，经过果蔬保鲜剂（1-MCP）处理青花菜后，虽然没有影响叶绿素降解基因BoCLH1的表达，但诱导了BoCLH2的表达，抑制了BoPPH、BoPaO和BoRCCR的表达。Agustin等（2011）在对青花菜衰老过程中叶绿素降解的研究中发现，叶绿素降解与BoCLH1和BoCLH2的表达不存在相关性，而与BoPPH的表达相关。樊艳燕等（2015）在对青花菜衰老过程中叶绿素降解相关基因的表达分析中发现，耐保鲜贮藏性不同的青花菜叶绿素降解机制不同，在此过程中叶绿素降解含量的变化主要通过BoCLH2、BoPPH、BoPaO 以及BoRCCR 的表达量进行调节，而BoCLH1主要在衰老初始期降解叶绿素。

如果苜蓿青贮过程与前面所述的绿色植物枝叶衰老过程中叶绿素降解代谢相似，那么必然会使苜蓿青贮丧失绿色。然而，我们在苜蓿青贮调制过程中发现发酵品质优良的青贮仍然表现出与原料苜蓿相近的色泽，显然这与前面所述研究中的结论不同。由此推测，如果苜蓿青贮过程中，引起以上叶绿素降解途径的相关降解基因表达发生改变，那么必然会影响叶绿素降解相关酶的活性，进而调控叶绿素降解代谢途径，从而使青贮苜蓿继续保持其原有的色泽。因此，测定分析苜蓿青贮过程中叶绿素代谢产物、酶活性以及相关基因表达的动态变化，可能会揭示苜蓿青贮过程中叶绿素降解代谢机制。