仔猪肠道菌群的建立与影响因素

侍宝路， 王计伟， 刘春雪

（安佑生物科技集团股份有限公司，江苏太仓215437）

仔猪肠道微生物生态系统的形成是一个动态的过程，新生仔猪从母体及分娩环境中获得胃肠道菌系并形成相对稳定的微生态环境 （Chen等，2018）；但在断奶阶段，由于断奶引起的一系列应激反应及日粮成分改变，使肠道内微生态环境发生剧烈变化（Gresse等，2017）。本文从仔猪肠道菌群的形成规律、影响因素和调控措施等方面，阐述仔猪肠道微生物与仔猪健康或疾病的关系，旨在为绿色健康养殖研究提供帮助。

1 仔猪肠道菌群的定植过程

仔猪刚出生便有微生物进入胃肠道中，在消化道内的定植顺序首先是需氧菌，然后是兼性厌氧菌，最后才是专性厌氧菌；而仔猪不同生长阶段，其肠道内菌群也会随之发生变化。

1.1 哺乳期仔猪肠道菌群的定植 初生仔猪肠道定植菌群最先来源于母猪阴道和胃肠道。在不被干扰的情况下，首先定植的是大肠杆菌（E.coli）和链球菌（Streptococcus）等需氧性菌群，消耗肠道中氧气，为随后而来的拟杆菌（Bacteroides）、双歧杆菌（Bifdobacterium）、梭菌（Clostridium）和乳杆菌（Lactobacillus）的定植创造厌氧条件（Petri等，2010；Konstantinov 等，2006）。 在出生 12 h 内，每克结肠内容物细菌数量可达109～1010，其中兼性厌氧菌以大肠菌群为主，但在48 h后被专性厌氧菌所取代，后者在结肠微生物菌落中占比达90%（Swords等，1993）。从出生到4日龄期间，仔猪肠道中首先存在的菌群主要包括大肠杆菌（E.coli）、梭菌（Clostridium）、梭杆菌（Fusobacterium）、链球菌（Streptococcus）和肠球菌（Enterococcus）等需氧性微生物，随着菌群定植过程进行，乳杆菌（Lactobacillus）、拟杆菌（Bacteroides）、普雷沃氏菌（Prevotella）和瘤胃球菌（Ruminococcus）等厌氧菌的丰度增加（Kubasova，2017）。菌群在胃中及小肠前段的停留时间比在大肠段较短，难以附着和增殖，而在大肠中消化运输较慢，故大肠中菌群数量和种类更多 （Hao等，2004）。大肠中厌氧菌为优势菌群，主要包括拟杆菌门（Bacteroides）、真菌（Eubacterium）、双歧杆菌 （Bifidobacterium）、丙酸杆菌（Propionibacterium）、梭杆菌和（Fusobacterium）和梭菌（Clostridium）（Gaskins，2001）。 出生第 1 周，厌氧菌逐渐成为优势菌群，且这种菌群优势会一直保持在哺乳期 （Swords等，1993）。由于哺乳期摄入较为稳定的母乳，肠道内菌群的发酵底物较为稳定，没有强烈因子干扰，此阶段仔猪肠道菌群逐渐稳定下来（Konstantinov 等，2006）。

1.2 断奶阶段仔猪肠道菌群的定植 仔猪断奶是其生长过程中的重要阶段，日粮改变、生活方式和环境的变化及由断奶引起的一系列应激反应，引起断奶腹泻（PWD），而引起PWD的关键因素之一即仔猪肠道菌群失衡。造成PWD最常见的因素是产肠毒素型（ETEC）大肠杆菌（E.coli）感染致病（Lalles等，2007b）。仔猪断奶后，盲肠中肠杆菌（Enterobacteria）与乳杆菌（Lactobacilli）的比例上升 （Castillo等，2007）；猪肠道乳杆菌（Lactobacillus sobrius）、嗜酸乳酸菌（Lactobacillus acidophilus）和罗伊氏乳杆菌 （Lactobacillus reuteri）数量降低（Konstantinov 等，2006），梭菌（Clostridium）、普雷沃氏菌（Prevotella）和大肠杆菌（E.coli）等兼性厌氧菌数量增加（Gresse等，2017），肠道菌群多样性降低，且抗生素生长促进剂（AGP）的使用会进一步降低菌群多样性（Zhang等，2016），增加病原微生物在仔猪肠道中定植的几率并引发疾病（Fouhse等，2016）。有研究发现，易受ETEC型大肠杆菌感染的猪肠道菌群多样性要低于不易感染的猪（Messori等，2013）。因此，多数研究将哺乳期仔猪肠道菌群组成和多样性作为PWD感染系数指标，但是能够准确预测到感染PDW的菌群基本特征还未清楚。有研究报道，与发生断奶腹泻的仔猪相比，未发生断奶腹泻的仔猪在出生第7天时，其肠道菌群均匀性较低，普雷沃氏菌（Prevotellaceae）、瘤胃球菌（Ruminocacaceae）和乳杆菌（Lactobacillaceae）的菌群丰度较高；通过回归分析发现，这些细菌，与未腹泻仔猪发生腹泻前一周肠道中的高丰度拟杆菌（Bacteroidetes）有很强的关系（Dou 等，2017）。

虽然目前将哺乳动物肠道微生物失衡定义为专性厌氧菌如梭菌 （Clostridia）和拟杆菌（Bacteroidia）丰度明显降低，兼性厌氧菌如肠杆菌（Enterobacteriaceae）的相对丰度增加（Winter等，2013），但是仔猪肠道微生态平衡的特征却不完全清楚。不过某些益生菌在肠道中有益作用已为学者所共识，如肠道中乳杆菌（Lactobacillus）是仔猪疾病预防的主要参与者，其在断奶过渡期间数量下降可导致疾病风险的增加 （Konstantinov等，2006）。因此，在哺乳期和断奶阶段，降低大肠杆菌（E.coli）和梭菌（Clostridium）等致病菌的数量，促进乳杆菌（Lactobacillus）、双歧杆菌（Bifdobacterium）等益生菌在肠道内的定植，可提高肠道免疫力，减少腹泻发生，从而减少抗生素使用。

2 仔猪肠道菌群定植的影响因素

仔猪肠道菌群处于动态变化之中，且未达到稳定状态前，易受到各种因素影响，其中来自母猪的因素和分娩环境决定了仔猪出生后最先接触的微生态环境，对整个哺乳期仔猪肠道菌群形成有着重要影响，仔猪日粮的组成、抗生素的使用、营养调控等也是影响仔猪肠道菌群建立的重要因素。

2.1 母猪和环境因素 微生物伴随着仔猪出生由口腔进入仔猪消化道中生长繁殖。来自于母猪阴道、乳汁、乳头和粪便的微生物最早进入仔猪消化道中，但来自乳汁和乳头的菌群在哺乳期并未长期定植，母猪阴道和粪便中的菌群则更加容易定植（Chen 等，2018；Inman 等，2010）。 母猪可通过乳汁和粪便将双歧杆菌（Bifidobacterium）、乳杆菌（Lactobacillus）、拟杆菌（Bacteroides）、副拟杆菌（Parabacteroides）和丁酸梭菌 （Clostridium Butyricum）等肠道厌氧菌传递给初生仔猪（Jost等，2014）。仔猪在哺乳期的营养来自于母乳，较为稳定，母乳中的寡糖可促进仔猪肠道拟杆菌（Bacteroides）、乳杆菌（Lactobacillus）和双歧杆菌（Bifidobacterium）的增殖，并在哺乳期结束时，形成母子相似的肠道微生态系统（Chen等，2018），但母乳成分的改变会造成仔猪肠道菌群的变化（Bian等，2016），在分娩前和哺乳期阶段，可通过营养手段调节母猪的肠道微生态达到改善仔猪肠道菌群的目的（Starke 等，2013）。

分娩环境中的微生物同样影响着仔猪肠道菌群的形成，最先进入仔猪肠道的菌群来自于分娩栏中的条形地板，虽然在哺乳期并未长期定植（Chen等，2018），但减少分娩栏病原菌的来源对初生仔猪肠道健康十分重要。生活在同一栏的仔猪菌群相似度，要高于来自于同一胎但分开饲养的仔猪肠道菌群相似度，这种同居环境效应在3～4周龄时十分显著 （Thompson等，2008）。仔猪阶段的环境因素，对其在育肥阶段肠道菌群结构和免疫发育产生重大影响，且户外田园的环境让猪只获得以乳杆菌（Lactobacilli）为主的健康肠道菌群（Mulder等，2009）。但是，关于母猪和环境因素对仔猪肠道菌群的影响却不尽一致，Gerzova等（2015）通过统计研究发现，与生活在传统室内农场的成年猪相比，生活在室外有机农场的成年猪肠道中双歧杆菌（Bifidobacterium）数量明显增加，但两者肠道微生物组成无显著差异；Kubasova等（2017）研究发现，1日龄和4日龄仔猪的肠道菌群结构与母体不同，说明仔猪在刚出生短时间内，肠道内菌群变化剧烈，来自于母体和环境的影响因素较为复杂，需要进一步深入研究。

2.2 日粮营养成分 仔猪断奶阶段，日粮由易消化的液体乳汁转变为不易消化、成分复杂的固态饲料，其可引起肠道菌群剧烈变化。而不同来源和水平的蛋白质和碳水化合物（尤其是膳食纤维）对断奶仔猪肠道菌群的影响不同（Pieper等，2015）。可发酵碳水化合物能够促进肠道乳杆菌（Lactobacillus）和双歧杆菌 （Bifidobacteria）的增长，从而增强对病原菌的定植抗性，增加肠道短链脂肪酸（SCFA）含量，有利于肠上皮细胞生长发育（Rist等，2013）。日粮中添加可溶性果胶和豆粕，仔猪回肠中乳杆菌（Lactobacillus）和普氏菌（Prevotella）丰度增加（Tian 等，2017）；而普氏菌（Prevotella）能够增强机体糖代谢，促进糖原储存，与日粮中纤维的消化有关 （Kovatcheva-Datchary等，2015；Wu等，2011；De Filippo 等，2010）。在断奶仔猪日粮中添加不可溶纤维，能够促进纤维分解菌增殖，阻断病原菌对肠黏膜的黏附（Molist等，2014），但要注意添加量，当不可溶纤维（稻草、燕麦皮、甜菜渣、麦麸）添加量达到5%时，会降低仔猪回肠营养物质表观消化率，腹泻率增加（Berrocoso等，2015）。

在日粮氨基酸平衡的基础上，需要一定的蛋白质浓度保证仔猪的生长发育。肠道微生物对蛋白质的发酵是通过氧化还原反应实现，即对氨基酸（AA）的脱氨和脱羧作用，这类肠道微生物包括大肠杆菌（E.coli）、链球菌（Streptococcus）、产气荚膜梭菌（C.perfringens）、艰难梭菌（C.difficile）、脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）等。支链AA经脱氨反应后形成NH3、SCFA、和支链脂肪酸。而NH3与肠道毒素有关，可对小肠上皮细胞造成损伤（Davila等，2013），干扰结肠细胞对SCFA的氧化代谢作用（Blachier等，2007）。AA经肠道微生物脱羧反应产生一些如尸胺、组胺酪胺、色胺、甲胺、乙胺或丁胺等生物胺，高浓度生物胺造成仔猪腹泻（Kroger等，2013）。 梭菌（Clostridiales）、拟杆菌（Bacteroides）、普氏菌（Prevotella）、肠杆菌（Enterobacteriaceae）和链球菌（Streptococcaceae）对蛋氨酸、半胱氨酸、牛磺酸等含硫氨基酸代谢产生苯酚、吲哚和对甲酚等物质；H2S脱硫弧菌（Desulfovibrio）代谢产生H2S。蛋白质来源方面，与豆粕和棉籽粕相比，鱼粉会使断奶仔猪小肠内容物中埃希氏菌-志贺菌（Escherichia-Shigella）的数量明显增加（Cao等，2016）。低蛋白质日粮可提高肠道细菌中乳酸菌比例，降低断奶仔猪腹泻率 （Heo等，2013），这可能是由于可发酵纤维相关的菌群成为优势菌群，增殖代谢产生丁酸，增强了肠道免疫力（Opapeju 等，2009）。

肠道菌群对碳水化合物的发酵可能会减少对氨基酸的发酵（Lange等，2010），在断奶仔猪日粮中添加甜菜渣、谷物纤维、抗性淀粉等，可以减少肠道菌群对蛋白质的有害发酵（Pieper等，2014）；但日粮中粗蛋白质含量、纤维的来源及肠道菌群对其发酵程度，决定了抑制蛋白质发酵程度（Tudela等，2015）。因此，关于肠道微生态相关的可发酵蛋白质与可发酵碳水化合物的最佳比例还不清楚，包括不同来源蛋白质与纤维原料的物理特性（黏度和持水力等）和发酵特性，需要进一步深入研究（Pieper等，2015；Rist等，2013）。

2.3 抗生素 由于不同抗生素的抑菌谱不同，在使用过程对仔猪肠道菌群的影响也不同（Holman等，2014）。虽然健康肠道微生态系统的基本特征还不清楚，但长期使用AGP使具有抗性基因的致病菌在仔猪肠道内富集，包括志贺氏菌（Shigella）、大肠杆菌（E.coli）和沙门氏菌（Salmonella），增加其定植和致病的几率（Schokker等，2014）；对动物机体先天性免疫系统的长期抑制作用，使仔猪对疾病的敏感性增加（Menendez等，2013），动物生长后期抗生素使用几率增加。因此，可通过调节肠道微生态系统，增加机体共生菌群尤其是益生菌活力，为动物胃肠道提供保护，增强肠道免疫力，以减少抗生素的使用。

2.4 益生元和益生菌添加剂 益生元是一种不易被消化，易被肠道益生菌特别是双歧杆菌（Bifdobacterium）和乳杆菌（Lactobacillus）代谢利用，调节肠道微生物组成和活性，对宿主产生有益生理效应的化合物（Bindels等，2015）。益生元主要是指非淀粉低聚糖，常见的低聚果糖（FOS）和反式低聚半乳糖（tGOS），能够促进短链脂肪酸（SCFA）产生菌的增殖，尤其是能够产丁酸的乳酸菌，增加肠道丁酸浓度，降低肠道pH，抑制梭菌（Clostridiales）和肠杆菌（Enterobacteriaceae）生长（Ducatelle 等，2015）。目前已经被确定的益生元包括：菊粉、FOS、tGOS、人乳寡糖（HMOs）；而具有益生元潜力的包括：抗性淀粉、果胶、阿拉伯木聚糖、全谷物、日粮中纤维和可以通过调节肠道菌群来发挥益生作用的不易消化的碳水化合物（Bindels等，2015）。益生元作为肠道菌群特有的“食物”，不同的益生元来源，其在肠道中发挥作用的位置，对肠道菌群的选择性，可被发酵程度以及在仔猪日粮中的最适添加量等值得系统性地研究。

益生菌是指饲喂足够的量，能够给宿主带来好处的活性微生物（Hill等，2014）。这种“好处”表现为促进肠道内益生菌的生长，形成竞争性优势，酸化肠道，抑制病原体生长和定植，提高肠黏膜免疫，乳酸菌如乳杆菌（Lactobacillus）、双歧杆菌（Bifidobacterium）、 肠球菌 （Enterococcus）、 链球菌（Streptococcus）、益生芽孢杆菌（Bacillus）和酵母菌（Saccharomyces）已被广泛应用于断奶仔猪日粮中。猪源乳杆菌（Lactobacillus）能够降低断奶仔猪肠道中肠杆菌（Enterobacteriaceae）的丰度（Pieper等，2010）；罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）可促进哺乳仔猪肠道双歧杆菌的增殖，降低肠道pH，降低大肠杆菌（E.coli）的丰度（Hou 等，2015）；枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌通过对病原菌的竞争排除，分泌抗菌化合物，抑制病原菌的生长，同时生长代谢过程中消耗肠道中氧气，促进肠道乳杆菌（Lactobacillus）和双歧杆菌（Bifidobacterium）的增殖（Li等，2018），芽孢杆菌在实际饲料生产中应用更强。但是有研究报道，鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）并没有对遭受ETEC型大肠杆菌（E.coli）感染的断奶仔猪发挥益生作用（Li等，2012c）；而且不同来源的肠道微生物会破坏哺乳仔猪自身菌群生态平衡，损害肠道健康（Diao等，2018）。因此，未来关于益生菌的应用研究应更多聚焦在使用阶段、作用机理、有效剂量和应用方式方面。

2.5 其他添加剂 畜牧业实际生产中，氧化锌能够预防仔猪断奶腹泻已被证实并广泛使用，但过高的使用量会造成环境污染。低剂量的纳米ZnO与高剂量普通ZnO相比，养殖效果相似或更好（Wang等，2017）。高剂量ZnO可降低肠道中肠杆菌（Enterobacteriaceae）、埃希氏杆菌（Escherichia）和部分乳杆菌（Lactobacillus）（Starke 等，2014），但有不尽一致的研究结果，其中乳酸菌影响存在种属特性（Vahjen 等，2011；Hojberg 等，2005），这可能与研究的肠道部位不同有关。

植物精油作为一种绿色添加剂具有良好的抗菌和抗病毒效果，能够增加仔猪肠道中乳杆菌（Lactobacillus）数量，降低大肠杆菌（E.coli）和肠球菌（Enterococcus）的数量（Zeng 等，2015），但某些植物精油的长期使用会有利于高抗性大肠杆菌菌株的出现（Chueca等，2016），而且其抗菌活性与精油的成分和来源有关，不同成分和来源的精油，其对益生菌和病原菌表现出的抑菌程度不同（Ambrosio等，2017）。除常见的ZnO和植物精油外，有机酸、酶制剂和中草药添加剂在肠道菌群中也发挥着重要作用，但实际生产中需要更加深入地研究，如有机酸的包被，中草药毒性等。

3 展望

自然界的微生物与动物进化至今，形成一种复杂的互利共生关系。目前，对于猪肠道微生物的应用研究更多是聚焦在如何减少猪肠道中病原菌的数量，而忽略了动物本身肠道微生物与动物健康相关的功能。目前许多应用问题值得我们深入研究，如关于人的肠-脑轴对机体内分泌和微生态的影响已经有很多研究，猪的应激反应是否对肠道微生态有影响；猪肠道微生态平衡所具备的菌群基本特征是什么；肠道微生物组分间的共生机制等。

饲用抗生素和ZnO能够有效预防仔猪腹泻，但滥用会造成环境污染和食品安全等问题。随着环保要求的严格，寻找绿色无污染的添加剂，如何设计合适的日粮配方，改善饲养卫生条件，提高肠道天然免疫力，减少抗生素的使用，是畜牧业面对的重要研究课题，所以，肠道菌群初始定植和断奶阶段是一个很好的调节窗口。

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