补益营卫方对衰老表皮结构蛋白对K4、K13的影响

焦翠琴 王浩 周小平

摘要：目的 观察补益营卫方对衰老表皮结构蛋白对K4、K13的基因和蛋白表达水平的影响，探讨补益营卫方延缓皮肤衰老的机制。方法 消化分离出年轻小鼠和自然衰老小鼠的表皮细胞，并进行传代培养，其中将自然衰老的小鼠表皮细胞分为2组，1组为常规培养，另1组为用含有2.5%补益营卫方培养基培养，然后采用荧光定量RT-PCR法和Western Blotting法分别检测细胞K4、K13mRNA表达水平和细胞K4、K13蛋白表达水平。结果 与年轻组比较，老年组的K4、K13mRNA与蛋白表达水平均显著升高（P<0.05）;经药物干预后衰老表皮细胞中K4、K13mRNA与蛋白表达水平较老年组均显著降低（P<0.05）。结论 补益营卫方可通过抑制衰老表皮结构蛋白对K4、K13的表达，起到延缓皮肤衰老的作用。

关键词：补益营卫方;皮肤衰老;角蛋白4;角蛋白13;中医药

中图分类号：R285.5  文献标志码：A  文章编号：1007-2349（2019）12-0054-03

皮肤是最早反应机体衰老的外在组织，皮肤衰老不仅影响人们的外在美容，而且还给人们的社交带来一定的困扰，且在病因学上与许多皮肤病有关联。皮肤衰老，它是一个复杂的现象，在皮肤老化过程中有一系列生物学的改变，如皮肤和皮下组织细胞成分的减少和免疫系统的改变[1]。目前，预防和延缓皮肤衰老已成为医学科学研究的热点之一，有研究发现角质形成细胞在皮肤衰老中发挥重要作用，角蛋白是表皮细胞的结构蛋白，是一类具有支撑和保护功能的纤维状蛋白质，具有维持细胞分化、参与细胞定位等功能[2]。同时《内经》认为，营卫和谐是人体生命活动赖以发生的基础，与皮肤生理病理有着十分密切的关系。营卫的盛衰是影响皮肤状态的重要因素[3]。营卫循行于全身各处，调节着五脏六腑及全身的机能，使人体机能活动正常。因此研究营卫与皮肤衰老的关系具有理论和實践意义。本实验研究补益营卫方对衰老表皮结构蛋白对K4和K13的影响，探讨补益营卫方延缓皮肤衰老的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验药物 补益营卫方药由生黄芪15 g，人参5 g，炙甘草7 g组成。购买于宁夏医科大学附属回医中医门诊部，常规水煎2次后合并滤液浓缩成1 g/mL（毫升含1 g生药），放置4℃冰箱冷藏备用。

1.1.2 实验动物 选用健康清洁级昆明种雌性小鼠，3月龄（年轻组）10只，重量（20～22 g）;14月龄（老年组）10只，重量（28～31 g）。

1.1.3 主要试剂和仪器 胎牛血清（美国，Gibco 公司）;DMEM（High Glucose）及磷酸盐缓冲液（BI）;D-Hanks液、中性蛋白酶（北京酷来博科技有限公司）;SW-CJ-1FD 型超净工作台（中国苏洁净化公司）;MEM—F12 培养基（美国，Gibco 公司）;Trizol试剂（BioFlux公司）;DNase I（TaKaRa公司）;HF-90恒温CO2培养箱（Thermo Scientific）;CKX41 型倒置相差显微镜（日本 OLYM-PUS 公司）;迷你离心机（杭州米欧仪器有限公司）;电泳槽（北京君意东方电泳设备有限公司）;PCR梯度扩增仪（北京索莱宝生物有限公司）、PCR仪（杭州米欧仪器有限公司）等均由宁夏医科大学解剖实验室和宁夏医科大学科技中心提供。

1.2 方法

1.2.1 细胞分离、培养、处理 取年轻组和老年组小鼠背部的皮肤，剪成1 cm×0.5 cm小块，制备成细胞悬液，按1×105/mL的密度接种在培养皿里，每次换液前后都在倒置显微镜下观察细胞的生长状况。待70%～80%的细胞融合后进行传代。其中老年组细胞分为2组，一组为常规培养，另一组为用含有2.5%补益营卫方药物的培养基培养，48h后收集细胞用于指标检测。

1.2.2 细胞K4、K13mRNA表达检测 采用荧光定量RT-PCR法。提取总RNA，逆转录合成cDNA。用Primer Premier 5.0软件设计靶基因K4、K13、内参GAPDH引物序列。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统扫描拍照，计算各样品的目的基因相对定量结果，即其他各个样品相对于对照样品，目的基因mRNA转录水平的差异。

1.2.3 细胞K4、K13蛋白表达检测 采用Western Blotting法。提取总蛋白后电泳、转膜及封闭;一抗孵育（兔抗人K17抗体滴度为1：1000），增强发光剂显像，曝光。二抗孵育（羊抗兔IgG抗体滴度为1：2000）1-2 h。以目的蛋白条带与相应内参GAPDH条带的灰度值比值作为其蛋白水平的相对表达量。

1.3 统计学方法 采用统计软件SPSS 21.0进行统计学分析，实验数据均采用均数±标准差（x±s）表示，多组均数采用单因素方差分析（one-way ANOV-A），组间两两比较采用方差分析、LSD检验。以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 补益营卫方对衰老小鼠表皮K4、K13mRNA表达的影响 实验结果见表1。与年轻组比较，老年组K4、K13mRNA表达水平显著升高（P<0.05）;经2.5%药物干预后，衰老表皮K4、K13mRNA表达水平较老年组显著降低（P<0.05），但高于年轻组的水平，提示补益营卫方对衰老小鼠表皮K4、K13m RNA表达水平具有明显的抑制作用。

2.2 补益营卫方对衰老小鼠表皮K4、K13蛋白水平的表达影响 实验结果见表2。与年轻组比较，老年组K4、K13蛋白水平表达显著升高（P<0.05）;经2.5%药物干预后，衰老表皮K4、K13蛋白水平表达较老年组显著降低（P<0.05），但高于年轻组的水平，提示补益营卫方对衰老小鼠表皮K4、K13蛋白水平表达具有明显的抑制作用。

3 讨论

在人体器官中，皮肤是最大的器官，它是抵当皮肤受外界侵袭的第一层保护膜，具有防护、代谢、免疫等诸多作用。皮肤衰老也是人体衰老外在最直观的表现，也是最容易察觉到的。随着生活水平的提高，人们越来越重视养生保健，以求延年益寿、延缓衰老，近年来大量的相关研究有力地论证了中医药在皮肤抗衰方面的一系列作用。中医学认为营卫二气关乎人体盛衰，是机体衰老与否的重要因素。同时，就机体全身而言，驻颜防衰也需要调理脏腑气血的平衡[4]。《难经·三十二难》曰：“心者血，肺者气，血为营，气为卫，相随上下，谓之营卫。”营气作为血的前体，进入血中成为血的一部分[5]。所以说，一旦营气亏虚会影响血液的生化，气血不足就会加速皮肤的衰老。因此，在延缓皮肤衰老时应注重营卫的调和，营气盛则血盛，营气衰则血衰，气血不足就会导致皮肤衰老;此外，卫气受损，皮肤抵当外邪的能力下降也会受到影响，皮肤也就更加容易受到外界因素的影响，营卫二气从内外两个不同方面影响着皮肤衰老的进程。因此，对于皮肤衰老，尤其是防治上，更应注重调理营卫[6]。

为此，导师周小平教授通过经典古籍《伤寒论》和《金匮要略》对营卫相关方剂的进行挖掘、整理和分析，并做进一步研究与探讨，认为“营气不足”是导致身体疼痛的主要病机，从桂枝新加汤证中选取补益营气的人参，从治虚劳的黄芪建中汤证选取补益卫气的生黄芪，再将益气调和诸药的药性炙甘草加入其中，组成了补益营卫方。且在前期的研究中发现，补益营卫方药在亚急性皮肤衰老模型中具有抗脂质过氧化、提高胶原水平和改善衰老皮肤形态学变化的作用[7，8]。因此本实验从补益营卫的角度再次出发，进一步探讨补益营卫方对衰老皮肤表皮中角蛋白K4、K13的表达影响。

角蛋白是中间丝蛋白中最大和最复杂的一组，其中表皮蛋白可以分为两型：I型角蛋白和II型角蛋白。其中一种I型角蛋白和另一种II型角蛋白形成“角蛋白对”，在一定的组织中特异地表达，特定角蛋白对构成的中间丝具有独特的物理性质，以适应不同组织对张力强度、柔韧性和动力学的需要。角蛋白在维持整个表皮结构上的完整性起重要作用。根据相关研究表明[9]，K4、K13是一对角蛋白对，它们主要通过黏膜非角化性复层鳞状上皮的方式进行表达，其表达异常的时候出现相关疾病为白色海绵样痣（WSN）。

K4属于Ⅱ型角蛋白，分子量约为54KD，是上皮非角化和分层标志，主要分布在口腔、鼻腔、食道、会阴等黏膜，赋予非角化黏膜以弹性和柔韧性[10]。K4还与上皮不典型增生和癌变有关，口腔白斑（Oral Leukoplakia，OLK）重度不典型增生组织中K4 mRNA水平明显低于轻中度不典型增生者，口腔鳞状上皮细胞癌（oral aquamouscell carcinoma，OSCC）组织中K4 mRNA明显低于白斑患者[11]。而笔者实验研究发现老年组小鼠较年轻组小鼠的K4蛋白表达量和基因表达水平明显增高，可以推断这种表达量的增高可能与不典型增生有关，年龄越大，衰老小鼠的不典型增生越多，说明其皮肤衰老越严重，经2.5%的药物干预治疗后老年组小鼠K4的蛋白表达量和基因表达都显著下降，这说明补益营卫方有抑制皮肤不典型增生的作用，从而达到延缓皮肤衰老的作用。

角蛋白13（K13）属Ⅰ型角蛋白，相对分子质量54×103。K13是鳞状上皮细胞转化及分化的标志[12]。研究发现它与多种鳞状细胞癌的发生、发展密切相关，包括鼻咽癌、食管癌、宫颈癌、皮肤癌等[13，14]，这些肿瘤中的K13基因多表达异常。目前关于K13表达与肿瘤分化、临床分期、淋巴转移的关系，相关文献报道不尽相同。细胞角蛋白因在组织发生恶变后会出现差异性表达，被广泛应用于肿瘤的诊断[15]。李超，姜英俊等[16]认为通过诱导Jaridlb过表达的方法，证明了Jaridlb过表达抑制了低分化食管鳞癌细胞KYSE-150增殖并且促进其分化，并且使该细胞中K10和K13的表达水平明显上升，为食管鳞癌甚至其他鳞癌的治疗提供了可能的靶点。在我们的实验研究中发现，老年组小鼠较年轻组小鼠的K13mRNA表达水平和蛋白表达水平均显著增高，我们可以推断出这种增高可能与鳞状上皮细胞转化及分化程度有关，年龄越大，其鳞状上皮细胞转化及分化程度越高，表明衰老越严重，经2.5%的药物干预治疗后我们发现老年组小鼠的K13mRNA表达水平和蛋白表达水平均显著下降，这说明补益营卫方具有抑制衰老小鼠鳞状上皮细胞转化及分化的作用，从而达到延缓皮肤衰老的作用。

因此通过本实验笔者推测衰老的小鼠上皮萎缩、变薄，造成上皮屏障的损伤，与角蛋白对K4、K13上调引起的细胞骨架受损有关，不典型增生和鳞状上皮细胞转化及分化程度增高，使上皮细胞增生、转化及分化能力受到影响，上皮更新能力受到抑制，这充分表明其异常表达可能是鳞状上皮细胞转化和分化增多，引起衰老皮肤粗糙，机械屏障功能下降的原因之一，经补益营卫方干预后，衰老小鼠表皮细胞的K4、K13mRNA表达水平和蛋白表达水平显著降低（P<0.05）。说明补益营卫方能够通过降低角蛋白对K4、K13mRNA和蛋白的表达，减少鳞状上皮细胞转化和分化，调节表皮蛋白对K4、K13的表达，具有维持表皮结构蛋白表达水平稳定，延缓皮肤衰老的作用。

综上所述，可以得出补益营卫方通过有效抑制衰老皮肤表皮中角蛋白对K4、K13基因和蛋白表达水平，从而达到延缓皮肤衰老的作用。

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（收稿日期：2019-08-15）