响应面法优化南方红豆杉叶总黄酮提取工艺研究

王俊青，汪全，焦阳阳，李艳艳

（平顶山学院，河南平顶山467000）

南方红豆杉[Taxus chinensis（Pilger）Rehd.]为红豆杉科（Taxaceae）植物，为世界濒危物种，是我国特色的传统中药材，也是红豆杉科属中分布最为广泛、生长最快的植物，集药用、材用、观赏和科研价值于一身，素有“植物黄金”之称[1]。其中含有抗肿瘤的有效成分紫杉烷类化合物—紫杉醇，在治疗癌症方面被认为是当今最具潜力抗肿瘤药物之一[2-3]。紫杉醇主要来自红豆杉树皮，如果只单纯开发树皮易造成红豆杉资源匮乏，而红豆杉叶中的有效成分也较多，还不断更新，从而实现药用植物资源的可持续利用。研究表明，红豆杉叶中含有以苷类为主的黄酮类化合物[4]，黄酮类物质具有保肝、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化、治疗心血管系统等作用[5-10]，对红豆杉黄酮的提取工艺也有相关文献[11-15]，但对南方红豆杉叶中黄酮提取工艺研究鲜见报道。

响应面分析法是利用中心组合试验原理设计方法并经实验得到相关数据，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，研究因子与响应面之间、因子与因子之间的相互关系，来寻求最优工艺参数的一种数学统计方法[11]。本试验利用超声波的高速震动来破坏南方红豆杉叶粉末的细胞结构，便于溶剂乙醇渗透进入从而提取出黄酮。此法可以显著地缩短时间和提高黄酮的提取率。继而通过单因素试验和响应面分析法，优化筛选超声辅助提取南方红豆杉叶中总黄酮的最优提取工艺，以期为南方红豆杉叶中有效成分的开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

南方红豆杉叶取自湖北省襄阳市林业科学技术推广站。将其置于50℃的电热鼓风干燥箱中烘干后，粉碎，用60目筛网过筛备用。

1.2 仪器与试剂

T6新世纪紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；KQ-50DE数控超声波清洗机：昆山市超声仪器有限公司；101-1电热鼓风干燥箱、FW-100高速万能粉碎机：北京中兴伟业仪器有限公司；FA1104电子天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；TG16G台式高速离心机：湖南凯达科学仪器有限公司。

芦丁标准品：中美泰和生物技术（北京）有限公司；亚硝酸钠、六水氯化铝、氢氧化钠、无水乙醇（均为分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的制备

精密称取105℃干燥恒重的芦丁标准品10 mg，用无水乙醇溶解，并定容于5 mL容量瓶中，配成2 mg/mL芦丁标准品溶液，备用。

1.3.2 标准曲线的绘制

参考李铂的文献[15]并稍加改动：精密移取2 mg/mL芦丁标准溶液：0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.75、1.0 mL，分别加入一定量的蒸馏水溶液补充至1 mL，摇匀，配出一系列浓度芦丁标准液：0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 mg/mL。

从各标准液中分别取0.2 mL，依次加入3.4 mL无水乙醇溶液，加入0.5mol/L的NaNO2溶液0.15 mL，摇匀；再加入0.3 mol/L的AlCl3溶液0.15 mL，摇匀，放置5 min；最后加入1 mol/L的NaOH溶液1 mL，摇匀，以空白试剂作对比参照。在波长506 nm处测定其吸光度A值。并以吸光度（A）为纵坐标，芦丁标准液质量浓度（C）为横坐标绘制标准曲线，得到回归方程及相关系数 R2，见图 1。

图1 芦丁标准曲线Fig.The standard curve line

1.3.3 提取工艺

精密称取每份10.0 g南方红豆杉叶粉末于50 mL小烧杯中，在一定的料液比、提取时间、乙醇浓度的条件下，用薄膜胶布密封进行超声提取。提取完毕后，将其溶液摇匀，进行离心，离心速度为12 000 r/min，离心10 min，再取上清液至25 mL容量瓶中，然后加入同等浓度乙醇并定容至刻度线，摇匀。后续操作按照1.3.2中的步骤，取样加显色剂，平行测定数值3次。

1.3.4 黄酮提取量的计算

式中：E为黄酮提取量，mg/g；c为根据标准曲线回归方程求出的黄酮质量浓度，mg/mL；n为提取液的稀释倍数；v为离心液定容的体积，mL；m为样品质量，g。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 料液比对黄酮提取量的影响

设定乙醇浓度65%，提取时间60 min的条件下，研究料液比为 1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30、1 ∶35（g/mL）对南方红豆杉叶中黄酮含量的影响，如图2所示。

随着料液比的增加，黄酮提取量曲线呈上升趋势，在液料比为1∶30（g/mL）的时候达到最大值，随后曲线骤然降低。可能当料液比为1∶30（g/mL）时，南方红豆杉叶粉末中溶出的黄酮量达到饱和，因此得出最佳提取液料比为1∶30（g/mL），此时总黄酮含量为84.23 mg/g。

2.1.2 提取时间对黄酮提取量的影响

设定料液比1∶30（g/mL），乙醇浓度65%的条件下，研究提取时间为 30、40、50、60、70 min 对南方红豆杉叶中黄酮含量的影响，如图3所示。

图2 料液比对南方红豆杉叶总黄酮提取量的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the extraction content of total flavonoids from leaves of Taxus chinensis（Pilger）Rehd.

图3 提取时间对南方红豆杉叶总黄酮提取量的影响Fig.3 Effect of extraction time on the extraction content of total flavonoids from leaves of Taxus chinensis（Pilger）Rehd.

随时间的增长，曲线先呈上升趋势，在60 min时达到最高点，而后下降，说明此时黄酮提取量最大。因此得出提取最佳提取时间为60 min，此时总黄酮的含量为84.20 mg/g。

2.1.3 乙醇浓度对黄酮提取量的影响

设定料液比 1∶30（g/mL），提取时间 60 min的条件下，研究乙醇浓度为55%、60%、65%、70%、75%对南方红豆杉叶中黄酮含量的影响，如图4所示。

图4 乙醇浓度对南方红豆杉叶总黄酮提取量的影响Fig.4 Effect of the volume fraction of ethanol on the extraction content of total flavonoids from leaves of Taxus chinensis（Pilger）Rehd.

总体趋势是先升高到达一个最大值然后下降，说明此时黄酮提取量最大，因此得出最佳乙醇浓度为65%的乙醇溶液，此时总黄酮的含量为85.24 mg/g。

2.1.4 提取次数对黄酮提取量的影响

设定料液比 1∶30（g/mL），提取时间 1 h，乙醇浓度65%的条件下，研究提取次数对总黄酮提取量的影响，如图5所示。

图5 提取次数对南方红豆杉叶总黄酮提取量的影响Fig.5 Effect of the extraction times on the extraction content of total flavonoids from leaves of Taxus chinensis（Pilger）Rehd.

由提取次数1次到2次，黄酮提取量上升比较明显；2次以后，黄酮提取量上升不明显。提取次数过多，不利于节省时间，且浪费试剂，故后续响应面分析法试验均采用超声辅助提取2次。

2.2 超声辅助提取工艺研究

2.2.1 因素水平的选取

通过单因素试验结果，确定响应面法试验设计的因素和水平，即选取料液比（A）、提取时间（B）、乙醇浓度（C）3个因素，根据Box-Benhnken中心组合设计原理[16-17]，以各试验单因素最优取值点为中心，上下区域各取1个水平值作为响应面试验设计水平，如表1所示。

表1 响应面分析法试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

2.2.2 响应面试验设计与分析

以黄酮提取量为评价指标，设计三因素三水平17个试验点的响应面分析，其中零点试验重复5次，以估计误差，如表2所示。

利用Design expert 8.0.6软件对表2的结果进行多元线性回归拟合，得到总黄酮提取量（Y）对A、B、C的二次多项回归模型为（公式）：

表2 响应面设计方案与结果Table 2 The program and experimental results of response surface methodology

Y=106.16+2.77A-1.06B+1.36C+1.15AB-2.45AC+0.22BC-5.97A2-1.20B2-2.91C2

为了说明回归方程的有效性及各因素对提取量的影响程度，对上述回归模型进行方差分析，见表3。

表3 回归方程方差分析表Table 3 Variance analysis of mathematical regression model

由表3可知，模型P＜0.000 1，回归方程具有显著性，可用于替代试验点对试验结果进行分析，并进一步对回归方程各项作显著性检验。其中，料液比（A）、乙醇浓度（C）、料液比的二次项（A2）、乙醇浓度的二次项（C2）、料液比与乙醇浓度的交互项（AC）的P值均小于0.01，表明对总黄酮提取量影响极显著；提取时间（B）、提取时间的二次项（B2）、料液比与提取时间的交互项（AB）的P值均大于0.01小于0.05，表明对总黄酮提取量影响显著；乙醇浓度与提取时间的交互项（BC）的P值大于0.05，说明对总黄酮提取量影响不显著。该拟合方程的二次项均为负数，所以开口向下，相应的响应图见图6～图8。

图6 提取时间与料液比响应图Fig.6 The response surface between ultrasonic extraction time and solid-liquid ratio

图7 乙醇浓度与料液比响应图Fig.7 The response surface between volume fraction of ethanol and solid-liquid ratio

图8 乙醇浓度与提取时间响应图Fig.8 The response surface between volume fraction of ethanol and ultrasonic extraction time

失拟项检验的P值为0.008 8（小于0.01），表明模型充分拟合试验数据，受其他因素的影响不显著。在所选取的各因素水平范围内，按照对结果的影响排序：料液比＞乙醇浓度＞提取时间。

2.2.3 最优提取工艺的确定

利用Design expert 8.0.6软件对提取工艺条件进行优化，得出理论最优超声提取的工艺参数为：料液比1∶30.84（g/mL），提取时间56.52 min，乙醇浓度65.75%，该条件下总黄酮的理论提取量为106.68 mg/g。为了在试验中操作方便，提取工艺条件修正为：料液比 1 ∶31（g/mL），提取时间 57 min，乙醇浓度 66%，超声提取2次下进行验证，结果见表4。

表4 试验验证响应面优化条件Table 4 Conformation results of the optimized extraction conditions

测得总黄酮提取平均值为106.58 mg/g，RSD=0.68%，结果与软件分析得到的预测值相近，证明试验模型选择可靠，此提取工艺可行。

3 结论

本试验根据Box-Benhnken中心组合的试验设计原理建立南方红豆杉叶中总黄酮提取工艺的优化回归方程模型，经方差分析该模型拟合度较好。结果表明：料液比、乙醇浓度对总黄酮提取量影响极显著，而提取时间的影响只是显著。同时，借助单因素实验可知，提取次数过多，不仅费时，还浪费试剂，故均采用超声辅助提取2次。因此确定超声辅助提取南方红豆杉叶中黄酮的最优提取工艺参数为：料液比1∶31（g/mL），提取时间57 min，乙醇浓度66%，南方红豆杉叶中总黄酮提取量为106.58 mg/g。