激素性股骨头坏死动物模型的建立及评价

蒋玮，曹林忠,2*，邬明峻，张琪

(1. 甘肃中医药大学， 兰州 730000； 2. 甘肃中医药大学附属医院脊柱外科，兰州 730020)

1957年由Pietrogramde和Mastomarine第一次提出短时间大剂量可的松会引起股骨头坏死(osteoarthrosis of femoral head, ONFH)之后，人们逐渐认识到长期服用糖皮质激素会导致激素性股骨头坏死(steroid-induced avascular necrosis of the femoral head, SANFH)的发生。然而激素在人体内引起ONFH的机制尚不明确，主要有脂肪代谢紊乱、血管内凝血和骨质疏松三种假说[1]。激素进入人体后会影响内分泌调节，导致血脂增高，易堵塞微小血管，进而引起股骨头局部缺血坏死；股骨头坏死患者的血液粘稠度高，在激素的刺激下，容易发生高凝状态及血管内凝血，从而出现股骨头缺血坏死；骨量减少、骨小梁变细、变薄是激素的副作用之一，在外部应力的作用下，股骨头常发生软骨下骨折、局部塌陷导致血液循环障碍，引起股骨头缺血坏死[2]。

随着研究不断深入，SANFH研究进入细胞、分子及基因领域，主要有激素代谢紊乱、干细胞分化和基因多态三种假说。有研究者[3]发现人体内细胞色素P4503 A酶的活性与糖皮质激素清除成正相关，酶活性的降低可导致体内激素作用时间增加，副作用也随之增加，最终导致股骨头坏死。研究发现，糖皮质激素会促进骨髓间充质干细胞向成脂分化、减少成骨分化，导致股骨头坏死。mRNA作为调节因子，调控细胞的整个生命周期，但它是否参与SANFH的发生，当今尚不清楚，吴兴净等[4]实验研究发现上调的miR-125α-3p和下调的 miR-17-5p可能参与激素性股骨头坏死的发生，但还有待进一步验证。

然而无论是三种坏死机制假说，还是更进一步的细胞、分子及基因研究，SANFH动物模型的建立是研究的基础，本文就以“激素性股骨头坏死及，造模”为检索词在CNKI数据库中，从2009年01月01日至今，共检索出相关文献190篇；以“animal model of steroid-induced avascular necrosis of the femoral head”为词条在PubMed中共检到文献58篇。按照①股骨头坏死；②激素性；③股骨头坏死病因及机制；④动物模型；⑤造模方案；⑥造模成功标准，符合其中多项或一项为入选标准，排除较陈旧、相似或重复研究的文章，最终选择37篇文章进行分析、归纳、总结，将最近10年来国内外对造模方案、动物选择及造模成功标准进行简要综述，为SANFH动物模型建立提供参考。

1 SANFH造模方案的选择

激素在动物和人体中有大致相似的作用机制，为了建立与人类SANFH病因及发病过程相似的动物模型，总结常用SANFH的建模方法有单纯糖皮质激素诱导、异体血清联合激素诱导和脂多糖联合激素诱导。糖皮质激素可使血管胶原纤维和弹性纤维结构和功能障碍，从而导致骨组织小动脉的断裂或栓塞，导致骨细胞缺血和骨髓内高压引起股骨头坏死，糖皮质激素还可抑制干细胞成骨分化，促进向脂肪细胞分化，导致SANFH的发生[5]。然而大部分患者因为血液、免疫系统或其他疾病，使用激素治疗时，出现了股骨头坏死的副作用。所以为了模拟这一发病过程，常使用异体血清制造模型动物的血液和脉管系统炎症，或者使用脂多糖引起微循环障碍，再使用激素干预，最终形成SANFH。

1.1 糖皮质激素诱导

糖皮质激素的使用是导致SANFH的主要原因。常用的糖皮质激素有醋酸泼尼松龙、地塞米松、甲基强的松龙和甲基氢化泼尼松琥珀酸钠等。不同激素和使用剂量的不同对实验动物有不同的影响。范武等[6]通过每周2次日本大耳兔左侧臀肌注射10 mg/kg的醋酸泼尼松龙注，连续4周后成功造模。赵振广等[7]给大鼠每周2次腹腔注射地塞米松10 mg/kg，持续8周的方案成功建立SANFH的早期模型。Kuribayashi等[8]通过肌肉注射甲基强的松龙20 mg/(kg·d)的方式建立兔SANFH模型，4周后有70%的发生ONFH，然而在肌肉注射甲基强的松龙后，有20%的试验动物死亡。王荣田等[9]用雌性来航鸡，每周2次胸肌注射甲基氢化泼尼松琥珀酸钠5.2 mg/(kg·week)，预防性注射青霉素2×104U/kg、链霉素50 mg/kg，连续8周后造模成功。但李兴国等[10]通过新西兰大白兔双侧臀肌连续9周注射地塞米松2.5 mg/(kg·d)，并且连续1周臀部肌注8×104U/d庆大霉素，未成功造模，且动物死亡率高达25%。

单纯糖皮质激素诱导SANFH模型的方法优点在于制模过程操作简单，所用药物价格便宜，经济负担较轻，但SANFH患者常患有多种基础疾病，所以单纯使用激素制模与人类实际发病过程有较大的差异。也有研究者表明[11]单纯激素不能成功诱导SANFH动物模型，这一结论还有待进一步的验证。

1.2 异体血清加激素诱导

为了使建立的模型更有说服力，发病过程与人类相似，常使用异体血清制造模型动物的血液和脉管系统炎症，再加入激素干预进行造模。1992年,Matsui等[12]首次通过兔耳缘静脉注射马血清10 mL/kg，2周后再次注射相同剂量，同时连续3天腹腔注射40 mL/(kg·d)的甲基强的松龙，4周后能在组织切片上观察到骨髓坏死，6～8周后出现骨坏死，最终70%的动物成功制作SANFH模型。周正新等[13]兔耳缘静脉注射马血清10 mL/kg，第3周后，注射剂量为7.5 mL/kg，第5周后，连续3天45 mg/(kg·d)的甲基强的松龙，之后连续10周腹腔注射7.5 mg/(kg·week)的甲基强的松龙，并臀部肌注4万单位/只青霉素钠预防感染后成功造模。佟鹏等[14]通过间隔12周兔耳缘静脉注射两次马血清10 mL/kg后，连续6天，臀肌注射8 mg/(kg·d)的醋酸泼尼松龙，以80%的成功率获得SANFH模型。

马血清进入动物体内后，因免疫反应使动物出现血管炎型超敏反应，导致血管局部免疫复合物的沉积，并在免疫系统等的参与下，引发一系列的反应致组织损伤，进一步使用糖皮质激素引发SANFH[15]，这一过程很好的模拟了人类疾病的发生发展过程。

1.3 脂多糖联合激素诱导

革兰阴性细菌细胞壁中有一种特殊物质，叫做脂多糖，它能促进血管活性物质如缓激肽、组胺、血管紧张素、白介素-6等物质释放，导致微循环障碍，在此基础上进行激素的干预，最终导致ONFH[16]。李瑞琦等[17]对兔连续3 d肌肉注射青霉素4×105U预防感染后，间隔24 h耳缘静脉连续两次注射20 μg/kg内毒素，第二次注射完毕内毒素后，每间隔24 h臀肌注射20 mg/kg甲基强的松龙，此后每周2次肌肉注射4×105U青霉素预防感染，注射期间动物死亡3/21，4周后成功建立SANFH模型。阮康明等[18]通过犬耳缘静脉间隔24 h连续两次注射10 μg/kg内毒素，在第二次注射内毒素的同一天开始，连续注射2周，臀肌注射甲基强的(10 mg/kg)，间隔1周后，再继续注射2周，成功获得模型。Zheng等[19]对鸸鹋序贯注射内毒素及甲基强的松龙，也成功获得SANFH的临床前期研究的模型。于鹏等[20]对兔间隔24 h连续两次静脉注射10 μg/kg大肠杆菌内毒素后，间隔24 h连续3次臀肌注射20 mg/kg醋酸泼尼松龙，注射完成后周第四以28/32的比率获得SANFH动物模型。王泳等[21]完全按照Yamamoto等[22]的方法制作动物模型，内毒素100 μg/kg联合甲基强的松龙20 mg/kg，实验动物在注射内毒素后2 d内死亡率接近80%，但将内毒素的剂量降低至20 μg/kg，动物的死亡率下降至不到10%，并通过组织形态学检查得出了与高剂量制模方法一致的病理结果。还有研究者[8]发现内毒素联合激素组比马血清联合激素组稍早出现股骨头坏死。肖春生等[23]经实验验证了这一观点成立。也有研究者[24]发现内毒素导致的股骨头组织中肿瘤因子α明显增高，提示该方法导致的ONFH可能与肿瘤因子密切相关，但还需进一步验证。所以小剂量脂多糖联合激素能成功制造SANFH模型，且具有动物模型发病机制与人类相似，成功率高，实验动物死亡率低的优点。

2 模型动物的选择

为了模型动物尽可能的与人类有相似的SANFH发生过程，模型动物应有以下特点：①实验动物与人类亲缘。②实验动物尽可能从组织学、生理学模拟人类SANFH的整个过程。③生物力学效应与人类相似。④实验动物具有良好的重复性，有明确的制模成功评价标准、价格低廉、饲养方便[25]。目前造模常用动物是以鸡为代表的双足类动物和以大鼠及兔子为代表的四足类动物[26]。

2.1 双足类动物

生物力学效应与人类相似的双足类动物，在站立行走时双侧股骨头均受压，一旦出现局部缺血坏死，在集中应力的作用下，病程进展较迅速。且双足类动物大多为禽类，在进食高脂肪饲料或激素刺激后易出现血脂增高和血液粘滞性增高，易形成股骨头缺血坏死。万蓉等[27]、孔祥英等[28]通过胸肌注射甲基泼尼松琥珀酸钠后成功获得鸡SANFH模型。曲春涛[29]采用液氮冷冻并射频加热交替法损伤股骨头建立鸸鹋股骨头塌陷模型。但禽类动物与人类亲缘性较远，生理生化方面与哺乳动物有较大的差别。

2.2 四足类动物

四足类动物与人类具有相似的生理生化及基因，常用的四足类动物有大鼠和兔，其次还有犬、绵羊等动物。为了避免物理或化学刺激后产生的疼痛，四足类动物常出现减少患肢负重的保护性行为，减少了生物力学效应在ONFH过程中的作用。针对这一问题Mihara等[30]通过强迫四肢动物站立，增加造模成功率。有研究者[31]在其它条件相同的前提下，仅通过调整饲料高度迫使实验组动物站立取食，并予跑步机跑步2 h/d增加运动，结果表明实验组造模成功率提高约15%。

犬因体型较大，常用于建立创伤性ONFH模型。巩建宝等[32]、谢志涛等[33]分别使用液氮冷冻法和内毒素联合甲强龙成功建立犬ONFH模型。羊长骨内脂肪丰富，适合建立减压性ONFH模型，但犬和羊价格昂贵，场地要求高，饲养不便利，不经常用于实验研究。相比于犬和羊，大鼠、兔没有上述顾虑，大鼠寿命较短，可以用于早期ONFH模型建立，但不利于晚期塌陷模型的建立。兔体型适中，饲养便利，寿命较长，是良好的动物模型的选择对象。

3 造模成功的标准

验证动物模型是否制备成功，是实验顺利进行的关键步骤。常用的验证方法有影像学评估、病理学验证、实验室检查以及形态学观察等。

3.1 影像学评估

影像学评估是最简便的方法，国际骨循环学会(Association Research Circulation Osseous, ARCO)对股骨头坏死的分期：0期和Ⅰ期ONFH动物行髋关节正位X线和普通CT结果无异常表现，对此赵振广等[7]研究者已做过相关验证。股骨头X线表现为斑片状阴影，硬化及囊肿形成，但股骨头无塌陷，为II期；表现为骨性关节面的下方出现新月形透明带，即“新月征”，则为III期；表现为股骨头塌陷，关节间隙变窄，囊性变等，为IV期。普通CT可较X线早发现II期股骨头坏死。Micro-CT能检测骨小梁骨微结构的定量指标[34]，能发现I期ONFH骨小梁变细、变薄甚至断裂，但Micro-CT不能显示软组织及股骨头内骨髓、脂肪变化，不能发现0期股骨头内骨髓及脂肪变化，且检查费用昂贵不常使用。MRI可将股骨头外形、关节间隙、关节积液、股骨头内信号均匀程度、骨髓是否水肿以及骨坏死信号等均能显现。T1 WI上表现为点状、细线状、片状低信号强度，T2 WI上表现为点状、细线状、片状高信号强，脂肪抑制序列呈现高信号示骨髓水肿，为0期ONFH，张林波等[35]做过相关验证。还有学者采用血管造影的方法观察股骨头内毛细血管情况，发现造模后股骨头内毛细血管明显减少并迂曲，但无法显示微小动脉状况，且无法判断股骨头坏死处于那一期，使用较少。

3.2 病理学检查

病理学检查是验证造模成功的金标准，动物处死后取股骨头制作病理切片，观察到空骨陷窝数量增加，骨细胞中脂滴充满，细胞核被挤向边缘，骨髓造血组织减少，脂肪细胞堆积骨小梁稀疏、变细变薄，甚至断裂，骨细胞核固缩溶解、消失，成骨细胞消失，脂肪组织和增大的脂肪细胞占据骨髓区，按ARCO标准，为0期股骨头坏死。李传将等[36]、陈达等[37]、李磊等[38]经实验进行相关验证。虽然病理学检查标本能检测出超早期股骨头坏死，但需处死动物后才能得到切片，若需后续在体实验，将无法逐一进行验证，动物因个体差异将存在实验误差。

3.3 实验室检查及形态学观察

实验室检查发现血液中血清胆固醇和甘油三酯均升高，股骨头内血流动力学测定减慢。但无法确定股骨头坏死处于那一期。此外动物造模过程中和完成后常出现毛发、饮食、步态以及消瘦状况等形态学改变，动物注射药物后出现精神萎靡、皮毛欠光滑、大便稀、饮食减少、跛行、活动减少等症状，部分实验动物还出现溃疡、脱毛等症状[39]。

总的来说，早期SANFH造模成功主要依靠MRI及病理学的验证。

4 展望

人和动物存在较大的差异，动物模型的制备过程应尽可能的模拟与人类发病相似的自然病程和病理过程，但没有一种理想的动物及造模方法可以完全复制。动物模型的制备周期、制模成功率、制模成本均对实验有较大的影响。综上所述，不同的动物在不同的模型建立上有各自的优势，但没有一个完美的动物能建立与人类疾病发生极度相似的模型，根据自己不同的研究目的研究者应选择不同的动物模型及制模方案。综上所述，SANFH制模方案选择异体血清联合激素或者小剂量、高频率脂多糖联合激素，并给予强迫站立体位，加强运动来可增加制模成功率，给予药物的同时给予胃黏膜保护药物以降低动物死亡率。建立良好的SANFH模型是研究SANFH的关键，相信随着研究不断地深入，研究方法不断地改进，更好的动物模型将会建立，用以SANFH的预防和治疗研究。