人甲状腺癌细胞株移植免疫缺陷鼠建模的影响因素研究进展

朱丽茹，赵德善

(山西医科大学第二医院核医学科，太原 030001)

甲状腺癌是一种常见的内分泌恶性肿瘤，其发病率逐年增高，我国肿瘤登记中心相关数据表明，近年来，甲状腺癌位居城市地区女性恶性肿瘤第4位，据估计未来我国甲状腺癌发病率将以每年20%的速度不断增长[1]。应用甲状腺癌免疫缺陷鼠模型的动物实验在研究甲状腺癌的发病机制、发展过程及有效治疗方法等方面作用重大。因此，如何成功建立有效的人甲状腺癌免疫缺陷鼠模型是实验顺利进行的基础。本文就影响人甲状腺癌细胞株移植免疫缺陷鼠建模成功的相关因素做一简要综述。

1 一般影响因素

1.1 肿瘤细胞株

1.1.1 肿瘤细胞株种类

目前用于细胞水平及移植动物模型研究的甲状腺癌细胞株种类众多，根据分化类型可分为分化型甲状腺癌细胞株和未分化型甲状腺癌细胞株，而同等数量未分化或分化程度低的肿瘤细胞较分化程度高的肿瘤细胞接种时造模成功率更高。国内学者[2]通过建立不同分化程度的甲状腺癌免疫缺陷小鼠模型，评估其对化疗敏感性的研究显示，低分化及未分化甲状腺癌造模成功率相对高于乳头状甲状腺癌，说明肿瘤细胞的分化程度与建模能否成功密切相关。出现此类现象，与肿瘤细胞的恶性程度有关，肿瘤细胞分化程度越低其恶性程度越高。肿瘤细胞的增殖不同于正常细胞有自限性，且随着肿瘤细胞恶性程度的增加，其自身增殖能力增强，接近无限性增殖，因此造模成功率较高。

1.1.2 肿瘤细胞株的接种

接种的肿瘤细胞数量应介于1×105～1×106/0.1 mL，每只0.2 mL[3]，因此接种时应进行多次细胞计数取均值、“Z”字形进针以防止注射后细胞外溢，来确保移植细胞数量的准确性；接种的肿瘤细胞应选择处于对数生长期的细胞，胰酶消化贴壁细胞时应注意消化时间不应过度消化，保证细胞存活率>90%，以避免肿瘤细胞移植失败或移植后细胞变异。

1.1.3 移植方式

肿瘤细胞接种成功与否决定了造模的成败，其主要影响因素包括接种的细胞状态、数量级方式。根据实验目的不同接种方式可分为皮下接种、原位移植和静脉或心脏注射肿瘤细胞株等。皮下接种便于观察免疫缺陷鼠成瘤情况，对实行不同干预条件的实验对象有更直观的评估。皮下接种时，以近头侧皮肤松弛部较近尾侧成功率高且成瘤体积大，最佳注射部位为腋窝中部外侧皮下[4]，注射时以形成一个突起的皮丘为宜。原位移植的甲状腺癌免疫缺陷鼠模型能更准确的模拟肿瘤的生长情况，Morrison等[5]，利用未分化甲状腺癌(anaplastic thyroid cancer, ATC)细胞株8505C、T238及乳头状甲状腺癌(papillary thyroid cancer, PTC)细胞株K1/GLAG-66、BCPAP，以浓度为1×105/0.1 mL，每只0.5 mL，借助显微镜寻找免疫缺陷小鼠甲状腺后进行腺体内注射，于4～5周后以大于90%的造模成功率建立了甲状腺癌免疫缺陷小鼠原位移植模型。原位移植的甲状腺癌免疫缺陷小鼠模型的建立对操作者的专业素质要求较高，造模过程中常因找不到正常甲状腺组织而使原位移植造模失败。静脉或心脏注射肿瘤细胞株是制作远处转移瘤模型的有效方法，对研究肿瘤在体内的生物学行为及转移瘤的治疗等有极大的价值，相关学者[6]利用ATC细胞株8505C、C-643、SW-1736及滤泡状甲状腺癌(follicullar thyroid cancer, FTC)细胞株FTC-133、FTC-236等，经8～12周的SCID免疫缺陷小鼠尾静脉注射0.2 mL含3×104～7.5×105个肿瘤细胞的细胞悬液，成功建立了甲状腺癌肺转移及骨转移模型。

目前国内外已有部分学者逐渐将免疫缺陷大鼠应用于人源性肿瘤组织异种移植模型中，如彭秀华等[7]为评价涉及肝、血管等外科操作的肝转移治疗模式,成功地在26只5周龄裸大鼠(rnu/rnu)(Crl：NIH-Foxnl)体内建立了人结肠癌细胞肝转移模型；贾罗琦等[8]为获得较大的瘤组织及利于手术操作，成功建立了10只4～5周龄健康雌性裸大鼠(rnu/rnu)乳腺癌皮下移植瘤模型；国外学者[9]采用3 ～ 5周龄雄性裸大鼠(NIH-rnu)成功建立了原位非小细胞肺癌裸大鼠模型。综上所述，因大鼠甲状腺体积大于小鼠的甲状腺组织，在甲状腺癌原位移植模型建立过程中应用免疫缺陷大鼠可有效降低手术操作困难程度，进一步提高造模成功率。

1.2 免疫缺陷鼠

1.2.1 免疫缺陷鼠

免疫缺陷鼠是指由于先天性遗传缺陷或用人工方法造成免疫系统一种或多种成分缺陷的小鼠或大鼠，在研究人类许多疾病机理、研发药物、器官移植等工作中有重要的作用。自1968年相关科学家发现裸小鼠无正常胸腺、外周血淋巴细胞数量稀少以来，科学家们培育出了多种免疫缺陷鼠杂交品系，其中有免疫缺陷小鼠及免疫缺陷大鼠，如：多种免疫细胞缺陷的SCID小鼠、B-nsg小鼠、FPG大鼠及F344RG大鼠等。

如前所述，近年来国内部分异种移植模型的研究中应用了裸大鼠，目前成功造模的免疫缺陷大鼠异种移植肿瘤有黑色素瘤、恶性胶质瘤、结肠癌、肺癌、乳腺癌、子宫内膜癌、肝癌等。免疫缺陷小鼠较免疫缺陷大鼠在造模应用方面更为普遍，且具有价廉、易饲养、成本低、来源广及造模成功率高等特点，但近年来免疫缺陷大鼠的应用在逐渐增多。虽然免疫缺陷大鼠较免疫缺陷小鼠费用昂贵且在饲养等方面维持经费高，但是由于免疫缺陷大鼠与免疫缺陷小鼠生物学特性相似，且体型较大、适应性强、皮下成瘤体积大、取血量多、便于手术操作以及便于影像学观察等优势，在国外大量研究中，免疫缺陷大鼠在各类人类肿瘤的异种移植、药物研究、用于整形的皮肤移植等领域已得到广泛地应用[10]。而在用于多学科异种肿瘤研究方面，尤其是影像学评价时，免疫缺陷大鼠肿瘤模型具有明显优势。

1.2.2 鼠龄及生长环境

大部分免疫缺陷鼠并非完全缺乏免疫细胞，比如无胸腺裸鼠，体内几乎无T淋巴细胞，但NK细胞和B淋巴细胞活性仍然很高，而免疫缺陷鼠生长环境无法绝对无菌化，随着鼠龄的增加环境中的感染源可刺激其体内NK细胞等免疫细胞的活性增加，从而影响移植瘤免疫缺陷鼠模型的成功制作。3周龄及以下的幼龄鼠虽较6～8周龄的成年鼠更易成瘤，且瘤体侵袭性及转移性更高，但幼龄鼠发育不成熟，成瘤后死亡率较高，且不便于观察及进行后续实验研究。因此，从成瘤率和实验便利性角度出发，在相对无菌的通风清洁SPF级环境中，饲喂的6～8周龄的成年免疫缺陷鼠将成为最佳人肿瘤细胞接种鼠。

2 特异影响因素

2.1 免疫缺陷鼠的血清促甲状腺激素水平

促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)具有促进甲状腺滤泡上皮细胞增生、合成与分泌甲状腺激素等作用，在免疫缺陷鼠中TSH增高有助于肿瘤细胞的增殖。相关临床研究显示[11]，TSH水平在分化型甲状腺癌患者中明显高于良性甲状腺结节患者；且TSH浓度与分化型甲状腺癌发病率及淋巴结转移有明显的相关性；另外，当TSH水平升高，病变肿瘤体积也相应变大，提示血清TSH水平不仅对甲状腺癌的发生、发展有相关性，并且也是影响肿瘤生长体积的一个重要因素。

有研究者[12]将浓度为1×106/0.1 mL的人乳头状甲状腺癌细胞(TPC-1)皮下接种于35只雄性裸小鼠(BALB/c-nu/nu)颈背部，同时分为7组，给予不同浓度的重组人促甲状腺激素，观察16 d；结果显示，当作用的TSH达到一定浓度时，裸鼠成瘤速度较其他相关建模实验[13]明显加快(第3天成瘤)，且成瘤速度及肿瘤的体积与TSH浓度有相关性；同时，该实验用放射免疫法对瘤组织中的甲状腺球蛋白(thyroglobulin，Tg)进行测定，结果显示Tg的浓度与肿瘤体积的大小呈正相关。

目前对于TSH在甲状腺癌发生发展中的具体作用机制没有明确的定论，但相关临床研究及动物实验表明[14]，正常生理情况下，TSH与位于甲状腺滤泡基底膜的促甲状腺激素受体(thyroid stimulating hormone receptor, TSHR)结合，通过腺苷酸环化酶，引起c-AMP信号通路级联，调节甲状腺碘处理基因：Tg、甲状腺过氧化物酶(thyroid peroxidase, TPO)、钠碘转运体(sodium iodide symporter, NIS)等的表达；而在分化型甲状腺癌中TSH通过结合血管内皮生长因子、细胞生长因子及胰岛素样生长因子等细胞因子，引起受体功能区内基因的突变，致使其下游信号分子异常表达，直接或间接诱导分化型甲状腺癌(differentiated thyroid cancer, DTC)的发生，促进DTC癌细胞的增殖分化、侵袭和转移；同时，TSH可能会通过影响相关氧化蛋白酶信号通路诱导分化型甲状腺癌的发生和发展。

因此，在人甲状腺癌细胞株移植裸鼠模型建立过程中，一定浓度的血清TSH水平，对提高建模的成功率，加快免疫缺陷鼠成瘤有重要的意义，同时可减少接种所用癌细胞量，相对降低实验成本。

对于提高免疫缺陷鼠血清TSH水平的方法有：肌肉注射重组人促甲状腺激素；在建立异种甲状腺癌模型前先使免疫缺陷鼠甲状腺功能降低或缺失，即先建立甲减免疫缺陷鼠模型，利用甲状腺激素分泌的负反馈调节作用使免疫缺陷鼠血清TSH水平升高可增加建模成功率。对于成年的免疫缺陷鼠甲减模型的制备可根据具体实验需求及实验条件选用以下三种方法：药物诱导甲减模型[15]，131I诱导甲减模型[16]及甲状腺切除甲减模型[17]。

2.2 免疫缺陷鼠的碘营养状态

碘是调节人体甲状腺发育和功能的重要元素。碘不仅维持正常的甲状腺细胞同源异型增生，而且对甲状腺癌的发生也有一定的影响。更重要的是，碘可以诱导甲状腺癌细胞的细胞周期阻滞和凋亡[18]。

相关研究显示[19]，碘摄入量与甲状腺疾病发生发展的关系呈U型曲线，碘摄入不足和过量均会导致甲状腺癌的发生；其中慢性碘缺乏一直被认为是滤泡状甲状腺癌的危险因素[20]；而在既往碘缺乏的地区，在碘预防前后的研究中表明，补充碘可能会增加甲状腺乳头状癌的发病率[21]。碘缺乏引起的甲状腺癌组织病理学和激素水平变化与碘缺乏引起高甲状腺素血症的机制是一致的，这种机制是通过下丘脑-垂体-甲状腺轴的负反馈机制使TSH分泌增加来实现的。同时，低水平的碘可以通过促进活性氧而导致DNA损伤和突变，在一些致癌因素，如辐射及化学药物等存在时可促进肿瘤的发生[22]。然而，过量碘的促肿瘤机制还没有得到很好的研究。

在关于碘营养状态与甲状腺癌关系的动物实验研究中发现，低碘饮食的雌性大鼠TSH升高，54%～100%大鼠发生甲状腺肿瘤，主要是滤泡状腺瘤和滤泡状癌。用高碘饮食(约碘120 mg/d)喂养大鼠9个月，发现40%实验鼠甲状腺重量增加，但没有肿瘤发生[23]。

韩国是一个碘含量丰富的地区，据统计[24]韩国是世界上甲状腺癌发生率最高的国家之一。因此有学者研究了碘摄入量与甲状腺癌在韩国甲状腺结节患者之间的关系[25]，结果发现1170名甲状腺结节患者中18%经手术证实为甲状腺癌，而其中98%的患者被确诊为甲状腺乳头状癌，且其尿碘值均高于世界卫生组织的标准(100～199 μg/L)。

因此，在制作人甲状腺癌细胞株移植免疫缺陷鼠模型过程中，可根据所接种细胞株的种类不同对免疫缺陷鼠碘营养状况进行人为干预，以促进肿瘤形成。

甲状腺癌细胞株移植免疫缺陷鼠模型是人类甲状腺癌的一个缩影，对甲状腺癌的发病机制、药物治疗及131I治疗的机制等研究都有重要的意义；了解和熟知甲状腺癌免疫缺陷鼠建模过程中实验动物的选择、关键实验操作，以及明确实验动物血清TSH水平和碘营养状况等关键影响因素可以有效提高建模成功率，一个高效且成功的甲状腺癌动物模型可以缩短实验时间，节约实验成本，使研究者更好的完成实验研究内容，对研究甲状腺癌的防治措施至关重要。