反向遗传学技术应用于猪繁殖与呼吸综合征病毒研究的进展

郑海红，孙竹筠，张可煜，高 飞，韦祖樟

(1.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；2.广西大学动物科学技术学院，广西 南宁 530005)

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinere productive and respiratory syndrome virus，PRRSV)属于动脉炎病毒科(Arteriviridae)、动脉炎病毒属(Arterivirus)成员。根据血清学和遗传特性的差异，可将PRRSV 分为欧洲型(1 型)和美洲型(2 型)[1]。随着反向遗传操作系统的建立， 使对RNA 病毒基因组在其cDNA 分子水平上进行体外人工操作成为可能，如对基因进行点突变、缺失、插入、颠换、转位和互补等改造。近年来，科学家通过对PRRSV 基因组的反向遗传操作[2-6]，在研究PRRSV 的基因复制、亚基因组转录与表达调控机理、PRRSV 与宿主间的相互作用关系以及PRRSV 用于异源基因表达载体来开发抗病毒疫苗等研究，取得了一些显著成果。本文就应用反向遗传学技术来研究PRRSV 的进展报告做一综述。

1 应用于PRRSV基因组结构与功能方面的研究

1.1 PRRSV 5'UTR 的碱基缺失或突变对其功能的影响研究 通过比较分析不同PRRSV 病毒株的5'UTR 发现，无论是 1 型还是 2 型 PRRSV，5' 端的 30 个核苷酸高度保守，特别是前10 个核苷酸。为了研究5' 端这段保守序列对病毒复制的作用，Choi 等以感染性克隆pBAC/PRRSV/FL 为框架，将PRRSV 5' 端核苷酸逐一缺失，直至缺失到15 个核苷酸，共构建8 个突变体全长cDNA 克隆。结果显示，当5' 端共缺失掉9 个核苷酸时，未能拯救出突变病毒，且PRRSV 5'UTR 的5' 端前7 个核苷酸对病毒复制是非必须的，但这7 个碱基的缺失极大降低了PRRSV 的复制效率[7]；Choi 等还通过实验进一步证实了人为设计的5'AU- 富集序列能够恢复其5'- 近端7- 核苷酸缺失突变体的复制效率[7]。而Gao 等以感染性克隆pAPRRS 为框架，证实PRRSV 能允许5' 端16 个核苷酸的缺失，并进一步证实预测的二级结构中的茎环结构(SL1)对病毒的感染性至关重要[8]。另外，Lu 等还发现PRRSV 基因组5'UTR 中存在一个不同型间保守的茎环结构，将其命名为SL2，同样以感染性克隆pAPRRS 为平台，将SL2 进行一系列突变、缺失、替换，以改变SL2 结构，结果显示，PRRSV 5'UTR 中的SL2 为PRRSV 转录所必需，但对PRRSV 基因组RNA 的复制非必需，还证实N-SL2 发挥作用的关键元件是其茎结构而非“三核苷酸环结构”，只有保持该茎结构的完整性，才能保证病毒的复制及突变体全长cDNA 的拯救[9]。

总之，对PRRSV 而言，5'UTR 5' 端核苷酸的二级结构等高级结构较初级结构对病毒的感染性、基因组的复制及其亚基因组的转录更重要，至于Choi 等和Gao 等研究结果的不同，这可能与他们采用的不同感染性克隆框架有关[7-8]。

1.2 PRRSV 3'UTR 中的碱基缺失和突变对其功能的影响Sun 等以感染性克隆pAPRRS 为框架，构建一系列PRRSV 3' UTR 5'端前66 个碱基缺失的突变体，并将获得的突变体转染Marc-145 细胞以拯救其相应突变病毒。结果显示，尽管PRRSV 3' UTR 5' 端前66 个碱基的缺失突变体仍能在Marc-145 细胞中拯救出其相应突变病毒，但这种碱基缺失会降低病毒在Marc-145 细胞中的复制效率；此外，67 个碱基缺失突变体的转染不仅会降低PRRSV 亚基因组的合成丰度，而且无法拯救出相应突变体病毒[10]。Verheije 等以LV 株的感染性克隆为框架，将3'UTR 5' 端的7 个核苷酸缺失，构建的全长cDNA 突变体能够拯救出相应突变体病毒；当缺失32 个核苷酸时，未能检测到PRRSV 基因组RNA 复制，也不能拯救出相应的突变病毒；对其它位置的突变显示，PRRSV 3'UTR 3' 末端的4个核苷酸(5'-15517AAUU15520-3')中的5'-AU-3' 对突变病毒的拯救至关重要[11]。关于以上突变体无法拯救出突变病毒的原因，是突变或缺失影响到了PRRSV 亚基因组转录、基因组复制还是影响到了PRRSV 与细胞互作还有待于进一步研究。Yin 等通过对PRRSV 3' 末端保守序列进行一系列缺失、突变，发现PRRSV 3' 末端保守序列的初级序列较之其周围的二级结构对病毒的复制与感染性更加重要，推测该保守序列很可能为PRRSV 复制复合体的组装提供一个连接区域[12]。

1.3 PRRSV 转录调控序列(TRS)碱基突变对其功能的影响 位于PRRSV Leader 末端及各个ORF 前的转录调控序列(Transcription-regulating sequence，TRS，TRS-L 和 TRS-B)在sg mRNA 合成过程中起着重要作用，但其作用机制尚不清楚。Zheng 等以感染性克隆pAPRRS 为框架，采用插入、替换等一系列突变方式，鉴定了TRS 的核苷酸残基构成及外源序列对PRRSV 转录功能的影响。结果显示：(1)构成TRS 3 末端的CC 在相应的亚基因组转录中起着重要作用，部分CC 具有核苷酸序列特异性；单独突变CC 中的任一个C 不影响TRS 功能，且拯救的相应突变病毒与亲本病毒的生物学特性无差异；同时突变CC 能够严重影响相应TRS 功能，且无法拯救出相应突变病毒；形成 sg mRNA7 两个 TRS (TRS7.1-B 和 TRS7.2-B)均可单独调控PRRSV sg mRNA7 的转录，而对野生PRRSV 来说，TRS7.1-B 比 TRS7.2-B 更重要，即只采用 TRS7.1-B 转录sg mRNA7 的突变病毒比只采用TRS7.2-B 转录sg mRNA7的突变病毒更接近野生PRRSV 的生物学特性；TRS-L 与互补链的TRS-B 的配对是调控亚基因组转录的关键因素，但不是唯一因素。(2) PRRSV 可以采用外源序列中的类似TRS 序列作为启动子来调控新亚基因组的合成，同时也发现突变或外源序列的插入，导致PRRSV 可以启动其基因组中无活性的一段类似TRS 合成相应亚基因组或PRRSV 通过突变或缺失方式使PRRSV 基因组中无活性的一段序列变为类似TRS 来合成相应亚基因组。(3)上述研究结果进一步证实了所有获得拯救的突变病毒亚基因组中的leader-body 结合位点序列均来源于TRS-B[13-14]。由此可见，PRRSV 能灵活运用TRS，启动转录，通过突变TRS中的碱基，很难使其所在的TRS 功能失活，即使失活，PRRSV 也会启动其他TRS (野生株不启用)来完成转录，保证病毒自身的存活。

1.4 PRRSV 结构蛋白基因的碱基突变对其功能的影响

1.4.1 糖基化位点的改变对相应蛋白功能的影响PRRSV的 GP2a 、GP3 和 GP4 蛋白表面分别有 2、7 和 4 个 N- 糖基化位点。GP5 有2～5 个不等糖基化位点。应用反向遗传学技术，Wei 等根据丙氨酸扫描法(Alanine scanning)将糖基化位点NXS/T突变为AXS/T，发现GP2N184、GP3N42、N50 和N131 是病毒具有感染性所必须的；对GP5 膜外结构域的3 个N- 糖基化位点(N34、N44、N51)突变分析发现，N44 的突变能够导致全长cDNA 无法拯救出病毒，N33、N55、N33/N55 突变降低了病毒的生长滴度；研究还表明，突变病毒增强了对抗体的敏感性，突变病毒感染猪较野毒株感染猪能够产生更高水平的抗体，表明GP5 膜外区多糖的缺失能够提高病毒对中和抗体的敏感性及对其附近中和表位的免疫原性。对临床上能分离到的这些糖基化位点缺失突变株的序列比对显示，将糖基化位点中的氨基酸N→A 的突变可能改变病毒蛋白结构，进而影响了病毒的感染性[15]。Wei 等将糖基化位点中N 突变成临床突变株中存在的氨基酸，或者突变成与N 结构相似的氨基酸，以破坏糖基化位点，结果表明，GP2、GP3、GP4 或GP5 蛋白的任何一个糖基化位点突变，均不影响病毒的感染性；GP2、GP3 和GP4 蛋白表面的糖基化位点突变，也不能提高突变病毒对其抗血清的敏感性；突变GP5 表面所有的糖基化位点，尽管能拯救出病毒，但极大降低了突变病毒在细胞中的复制能力，且该突变病毒无法在猪体内复制；该研究还发现GP5 糖基化缺失提高了突变病毒对中和抗体的敏感性，而N44 糖基化的缺失并不影响病毒中和表位的免疫原性[16]。

1.4.2 ORF5a蛋白基因的突变对其功能的影响PRRSV ORF5a 蛋白是最近发现的小蛋白，其与GP5 蛋白N 端编码区部分重叠。在 1 型、2 型 PRRSV 感染性克隆(pARRSV、pAJXM 和pMSHE)中，将 ORF5a 基因的起始密码子突变失活，未能拯救出感染性的病毒粒子，表明PRRSV ORF5a 蛋白对病毒活力是必需的[17]。

1.4.3 N蛋白基因的突变对其功能的影响N 蛋白是最保守的病毒蛋白，其主要功能是连接基因组RNA 和其它结构蛋白的包装。通过反向遗传学技术证实，2 型PRRSV N 蛋白 N 端 aa5～aa13、aa39～aa42、aa48～aa52位氨基酸及其C 端最后4 个氨基酸均是非必需的，这些氨基酸的缺失并不影响病毒粒子的感染性；N 蛋白的半胱氨酸在动脉炎病毒属间缺乏保守性，2 型PRRSV N 蛋白含有 3 个保守的半胱氨酸(Cys23、Cys75、Cys90)，1 型PRRSV 和鼠乳酸脱氢酶病毒(Lactic dehydrogenase virus，LDV)的N 蛋白含有2 个保守的半胱氨酸，而马动脉炎病毒(Equine arteritis virus，EAV)和猴出血热病毒(Simian hemorrhagic fever virus， SHFV)的N蛋白无半胱氨酸[18]。Wootton 等和Zhang 等将N 蛋白中半胱氨酸突变成丙氨酸，发现突变N 蛋白中所有的半胱氨酸不影响病毒的感染性，表明半胱氨酸介导的N 蛋白同源二聚体对病毒的感染性是非必需的[19-20]。N 蛋白含有核定位信号(Nuclear localization signals，NLS)点，其在病毒感染早期能够进入细胞核，Lee 等以PRRSV 感染性克隆为框架，将NLS 位点中的43K 和44K，突变为43G 和44G，获得的全长突变cDNA 转染细胞后能够拯救出相应突变病毒，且获得的突变病毒将N 蛋白限制在细胞浆中，其生长滴度较野生病毒株低100 倍；将含有NLS 突变的拯救病毒感染猪后发现，猪尽管出现时间较短的病毒血症，但病毒能够刺激机体产生较高的中和抗体，表明PRRSV N 蛋白的细胞核定位可能会刺激猪体产生相应的感染PRRSV 免疫应答[21]。

1.5 构建嵌合病毒来解析病毒蛋白功能

1.5.1 构建嵌合病毒来解析病毒结构蛋白功能为鉴定动脉炎病毒与细胞嗜性相关的蛋白，以EAV 感染性克隆为框架，将 PRRSV 和 LDV GP5 的囊膜外结构域替代EAV 感染性克隆的相应区域，构建的EAV 嵌合克隆转染细胞后能够产生子代病毒，并保留其对BHK-21 和RK-13细胞的感染性，但不能感染猪或者鼠的巨噬细胞。将1 型PRRSV 感染性cDNA 克隆的M 蛋白膜外结构域的编码序列分别替换为LDV、EAV 和PRRSV VR2332 的相应基因组序列，构建的PRRSV 嵌合体均能够拯救出嵌合病毒，且嵌合病毒仍然保持对猪肺泡巨噬细胞的感染性，但不能感染BHK-21 细胞。上述研究结果表明，M 和GP5 蛋白膜外结构域并不决定动脉炎病毒的细胞嗜性[22-23]。以2 型PRRSV 感染性克隆为基础，将基因1 型PRRSV 的囊膜蛋白基因ORF2～ORF5 替换2 型PRRSV 感染性克隆相应区域，拯救出的嵌合子代病毒表现出与亲本骨架病毒相似的生物学特征，表明1 型PRRSV 的相应囊膜蛋白能够在2型PRRSV 中发挥功能；将EAV 的小囊膜蛋白GP2/GP3/GP4 编码区替换PRRSV 相应的GP2/GP3/GP4 区域，将嵌合感染性克隆pARRS-EAV234 转染细胞后能够拯救出嵌合病毒，且嵌合病毒vPRRSV-EAV234 扩大了对传代细胞系的细胞嗜性，嵌合病毒不但能够感染MARC-145 细胞，还能感染PRRSV 非允许的体外传代细胞BHK-21 和Vero细胞，但嵌合病毒无法感染PRRSV 易感的肺泡巨噬细胞(PAM)， 表明决定动脉炎病毒细胞嗜性的蛋白为GP2/GP3/GP4 复合物[24]。

1.5.2 构建嵌合病毒来解析病毒非结构蛋白功能为深入了解PRRSV 的生物学特性和毒力增强机制，采用反向遗传操作系统将弱毒MLV 株与强毒MN184 株嵌合来致弱强毒株MN184，结果显示，MLV 的5' UTR/ORF1 复制酶编码区和结构蛋白编码区ORF2～ORF7/3'UTR 均能够致弱强毒株MN184[25]。异源嵌合病毒致病力试验显示，高致病性病毒株FL12 的毒力因子主要位于nsp3～nsp8 和GP5 中[26]。2006年暴发的高致病性 PRRSV (HPPRRSV)的nsp2 编码区不连续性地缺失了30 个氨基酸，是该次流行的PRRSV 独特的遗传标志。为确定该30 个氨基酸缺失是否与病毒毒力增强有关，实验设计为以HPPRRSV 病毒株JXwn06 感染性克隆为框架，将其nsp2 缺失部分替换为低致病性病毒株(HB-1/3.9)相应区域，结果显示，构建的嵌合病毒对仔猪保持高致病性；而以该低致病性病毒株(HB-1/3.9)为骨架，缺失其nsp2 中的30 个氨基酸，嵌合病毒与亲本病毒一样，仍然对猪保持低致病性。由此表明，nsp2 的30 个氨基酸缺失并不是导致HPPRRSV 毒力增强的唯一原因[6]。还有研究将1 型PRRSV 5' UTR 替换至2 型PRRSV 感染性克隆pAPRRS 骨架中的相应区域，或将 1 型 PRRSV 3' UTR 替换至 2 型 PRRSV 感染性克隆pAPRRS 骨架中的相应区域，结果均表明，嵌合病毒与亲本病毒具有相似的病毒学和生物学特性[27-28]，表明1 型PRRSV 5' UTR 和 3' UTR 在功能上可以完全替代 2 型PRRSV 相应的 5' UTR 和 3' UTR，提示虽然 PRRSV 1 型与2 型5' UTR 间和3' UTR 间的一级结构均相差很大，但一些局部保守结构域起着关键的功能作用。

2 应用在疫苗方面的研究

动脉炎病毒属感染性克隆也可以作为新型的病毒 系统来表达外源基因有两个可能：一是能够产生携带外源基因的感染性重组载体/ 病毒，其次是能够产生携带外源基因具有复制能力但是不能增殖的复制子载体。目前，以PRRSV 的感染性克隆作为外源基因表达载体已有大量研究，结果显示，(1)外源基因得以稳定表达的关键是外源基因要单独作为一个亚基因组来转录和表达[29-31]；(2)研究发现，虽然ORF7 和3' UTR 间等均可作为外源基因序列的插入位点[32-33]，但ORF1 和ORF2 间是外源基因序列插入的最好位点。另外，关于PRRSV 作为载体表达外源基因的研究进展，李清清等做了详尽的综述报告[34]，可供学者们查阅参考。

3 展 望

综上所述，通过对PRRSV 的反向遗传操作，其基因组复制、亚基因组转录机制及基因组表达调控机理、病毒与宿主间的相互作用关系以及构建新型载体来表达外源基因进行疫苗的研制等方面研究均有了很大进展。相信随着反向遗传操作技术的不断进步，通过研究一系列与毒力相关的位点以及合适的外源基因插入位点，从而有针对性地对病毒进行有效的改造，不仅能够获得更理想的重组病毒，用来研制PRRSV 新型基因工程疫苗，还能找到治疗靶点来防治该病毒，达到净化该病毒的目的。