组织缺氧在黄体形成过程中的作用

刘召远，张正红，吴佳琦，王正朝

福建师范大学生命科学学院 福建省发育与神经生物学重点实验室，福州 350007

在哺乳动物中，促黄体生成素(luteinizing hormone，LH)峰诱导成熟卵泡破裂排卵，随后黄体形成。黄体是由分化的卵泡颗粒细胞与内膜细胞组成，排卵前可以合成并分泌17β-雌二醇。在LH峰之后，这些细胞迅速分化为黄体细胞，并分泌孕酮。黄体由颗粒细胞分化的大黄体细胞、内膜细胞分化的小黄体细胞、内皮细胞、周细胞和一些基质细胞组成[1- 13]。从卵泡到黄体过程中卵巢组织的结构与功能发生了巨大的变化，这与血管增生密切相关[5- 8]。随着卵巢卵泡的发育，卵泡液中氧浓度持续降低[9- 13]。由此可见，卵泡的成熟、卵巢的排卵及黄体的形成是在缺氧条件下进行的[1- 13]。因此，本文从排卵前与排卵后卵巢局部缺氧情况阐述黄体形成过程中卵巢功能与组织结构的变化情况，旨在进一步理解缺氧在黄体形成与卵巢生理调节中的重要作用。

卵巢的血流

20世纪70年代，一些研究采用电磁探针监控绵羊和牛卵巢动脉的血流，发现卵巢动脉血流的周期性变化，即在黄体期血流保持在较高的水平，在黄体退化时降低，直到排卵后第5～6天一直维持较低的水平，随后到黄体阶段开始升高[14- 15]。使用多普勒彩色B超对卵巢内血流进行监测[16- 17]，结果显示排卵前卵泡的血流面积与速度在LH峰之后短暂升高，这与血浆17β-雌二醇浓度升高及LH峰密切相关[16- 17]。通过注射促性腺激素释放激素诱导排卵，可以导致血流面积和速度持续升高120 h，并伴随着血浆孕酮的升高[16- 17]。血流的增加与血浆孕酮浓度之间的相关性与利用电磁探针的经典研究结果一致，表明卵巢的血液供应与卵巢中孕酮合成显著相关[14- 15]。由于血液供应影响组织中氧的水平，这些变化表明氧供应与类固醇激素合成之间存在密切联系。从黄体退化到黄体形成，卵巢血流量较低被认为是卵巢供氧量下降的基础[14- 15]，包括排卵前后卵泡颗粒细胞和内膜细胞的黄体化过程。

排卵前缺氧

有研究已经证实缺氧与缺氧诱导因子- 1(hypoxia-inducible factor- 1，HIF- 1)一样，参与类固醇基因的表达调控[1- 3]。缺氧(1%～3% O2)可以显著减少大鼠和猪颗粒细胞以及牛黄体细胞中孕酮合成[1- 3]。在3%、5%和10%氧浓度下培养牛中期黄体细胞24 h可显著减少孕酮合成，且3%氧浓度培养可显著降低细胞色素P450家族成员11A1(cytochrome P450 11A1，CYP11A1)(也称为P450scc)mRNA表达与活性[1- 3]。HIF- 1化学激动剂氯化钴处理睾丸间质细胞，可显著减少CYP11A1 mRNA的表达与孕酮的产生。研究显示HIF- 1可以结合并激活睾丸间质细胞中HSD3B基因的启动子，而在其他细胞类型中，缺氧可以降低芳香化酶的表达和活性。在人滋养层细胞中，HIF- 1通过雌激素相关受体α降低芳香化酶的表达，HIF- 1α还可以通过激活H295R细胞中miR- 98抑制CYP19A1 mRNA的表达[1- 3]。然而，目前尚不清楚缺氧是否也能抑制卵巢颗粒细胞内的芳香酶活性。

在哺乳动物卵巢中，大卵泡液中氧含量比小卵泡液中氧含量更低，其可以通过HIF- 1促进颗粒细胞中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的产生[9- 11]。在灵长类动物中，HIF- 1α几乎不在卵巢生长卵泡与有腔卵泡的细胞核中表达，但排卵时在卵泡颗粒细胞核中显著表达。排卵前卵泡迅速改变功能，排卵后黄体形成，伴随着剧烈的血管增生[9- 11]。由此可见，HIF- 1-VEGF诱导的血管生成系统可能参与了卵泡发育的后期阶段与排卵后黄体形成的起始阶段。在牛黄体细胞与人颗粒细胞中，HIF- 1α的表达受cAMP与缺氧互作的调控。化学性缺氧可以增加HIF- 1α蛋白的表达，并通过促黄体生成素和cAMP进一步增强其表达，表明HIF- 1α是在转录与转录后水平被诱导的。首先是促黄体生成素诱导其转录，然后在缺氧条件下HIF- 1α蛋白的稳定性及蛋白水平进一步增加。在排卵前卵泡发育的后期，缺氧情况通过多种现象的调节参与卵泡功能，如类固醇激素合成与血管增生。这种调控仅是整个排卵/黄体化系统的一小部分，且缺氧在这个阶段卵巢功能中的绝大部分作用仍不清楚，但缺氧产生的信号已经表明其在黄体化及黄体形成中具有非常重要的作用[4- 8]。

排卵中缺氧

在哺乳动物卵巢排卵时，许多趋化因子表达水平升高，如白介素- 8、单核细胞趋化蛋白- 1、生长调节的原癌基因-α、趋化因子配体5与胸腺表达趋化因子[18- 21]。CXC趋化因子家族的基质细胞衍生因子- 1及其受体CXCR4在排卵前调节卵泡功能，如CXCR4在排卵前表达升高。孕酮是排卵必需的，通过孕酮受体(progesterone receptor，PGR)发挥作用，同时还调节小鼠HIF- 1α、HIF- 2α和HIF- 1β基因的表达。另外，敲除孕酮受体的小鼠在促性腺激素诱导其超数排卵时，HIF- 1α、HIF- 2α和HIF- 1β的表达显著低于野生型小鼠，同时利用棘霉素抑制HIF- 1的转录功能明显减少3个排卵相关基因(ADAMTS1、VEGF、EDN2)的表达[9- 13，18- 19]，表明孕酮、PGR、HIF- 1和HIF- 2在排卵过程中具有重要作用。虽然缺氧的重要性及排卵过程中产生的信号得到越来越多的关注，但还需要进一步研究来了解缺氧信号与排卵信号之间的对话，以阐明缺氧在排卵中的作用。排卵后，破裂的卵泡组织立即形成黄体，同时伴随着功能与结构的变化。这些变化需要快速的血管增生来支持，而这种血管增生是由缺氧引起的[1- 13]。

排卵后缺氧

排卵后，由于出血、未成熟的血管以及没有血流供应的细胞增殖，破裂的卵泡被认为处于缺氧状态[4- 8]。在灵长类动物卵巢中，缺氧条件的已知标志蛋白HIF- 1α在排卵后第2天新形成的黄体中表达显著增高，同时发现在牛卵巢中，在排卵后第2～6天早期发育黄体组织中HIF- 1α的表达显著高于发情周期的其他阶段[9- 13]。尽管目前还没有确定某一物种黄体中的氧浓度，但关于HIF- 1α蛋白表达这些发现已经表明新生黄体组织是处于缺氧状态的。

在20世纪90年代早期，最早进行黄体形成过程中血管增生的研究。Ferrarra和Henzel于1989年首次证明VEGF是一种强有力的促血管生成因子，并发现其促进奶牛和妇女黄体形成过程中血管增生[22]。在1995年HIF- 1α发现后不久，研究表明HIF- 1α是VEGF的转录调控因子[9]。为了证实HIF- 1α参与黄体形成，HIF- 1的蛋白分析至关重要，因为HIF- 1主要受蛋白质羟基化调控[5- 8]。通常，HIF- 1α通过泛素-蛋白溶酶体途径迅速降解，但缺氧抑制HIF- 1α降解，并与HIF- 1β结合后发挥功能[5- 8]。在灵长类动物中，HIF- 1α免疫染色结果显示HIF- 1α在早期黄体细胞核中表达[23]。另外，在牛早期及发育阶段黄体中，HIF- 1α的表达比其他阶段黄体中的表达要高；在体外培养的牛早期黄体细胞中，缺氧诱导HIF- 1α及VEGF的表达；在牛黄体化颗粒细胞和人颗粒细胞中，化学性缺氧(氯化钴)也可以诱导HIF- 1α蛋白和VEGF mRNA的表达，且可以被LH进一步诱导[9- 13]。在卵巢类固醇合成细胞中，缺氧可以增加VEGF、内皮素- 2及成纤维细胞生长因子- 2的表达[18- 21]，表明这些因子也在黄体形成所需要的缺氧信号中发挥作用。例如，内皮素- 2可以诱导黄体发育特性的改变，如细胞增殖、VEGF/COX- 2增加；缺氧可以诱导人颗粒细胞中促血管生成因子白介素- 8的表达，且在牛黄体早期阶段白介素- 8的表达显著高于发情周期的其他阶段[18- 21]。因此，缺氧/白介素- 8系统诱导的血管增生对黄体形成具有辅助作用。由此可见，缺氧通过HIF产生的信号对黄体形成中的血管增生是必需的。

另外，缺氧可以促进黄体形成过程中黄体内皮细胞的增殖，如同黄体类固醇合成细胞。但排卵后黄体快速生长主要是由于类固醇合成细胞体积的增加，而不是数量的增多。黄体类固醇合成细胞在缺氧刺激下也表达VEGF，导致黄体血管增生过程中内皮细胞的增殖。目前，缺氧是如何诱导类固醇合成细胞增殖的机制仍不清楚，可能与HIF- 1α通路有关。

细胞缺氧反应

在哺乳动物中，几乎所有的细胞都具有一种保守的细胞机制来适应缺氧条件。缺氧可以特异性地激活HIF，其由α和β两个亚单元组成，形成二聚体，发挥转录因子的功能。通常情况下，HIF与其靶基因上的缺氧反应元件结合，调节其转录水平。HIF可通过多种机制启动对缺氧的防御，如缺氧诱导肾脏促红细胞生成素的合成，刺激红细胞生成，增加血氧量。同时，缺氧还可以诱导组织蛋白质合成，调节局部血流，如VEGF、内皮型一氧化氮合酶及血红素氧化酶- 1[4- 13]。VEGF刺激血管增生，并增加血管的通透性。内皮型一氧化氮合酶和血红素氧化酶- 1可以产生血管扩张物质一氧化氮和一氧化碳，增强缺氧组织的灌注[24- 26]。另外，缺氧可以诱导糖酵解酶的表达，如磷酸激酶- 1、烯醇化酶- 1和乳酸脱氢酶- 1；同时增加葡萄糖转运蛋白的表达，从而增加葡萄糖的摄取。

总结与展望

HIF- 1的发现阐明了许多类型细胞对缺氧的反应，其与病理性或生理性组织生长有关，如癌症及雌性生殖系统。HIF在多种器官中表达，表明这些器官细胞有能力对缺氧条件做出响应。在生殖生理中，缺氧是一个重要信号，缺氧产生响应在所有物种黄体形成中是必不可少的。然而，缺氧对黄体形成的一些调控机制仍不清楚，如HIF- 1α在缺氧和不缺氧条件下均受生殖激素人绒毛膜促性腺激素和LH的调控。深入理解缺氧产生的信号与生殖激素诱导的信号之间的对话有助于进一步阐明缺氧在黄体形成以及卵巢生理调控中的作用。