牙周膜干细胞膜片复合生物陶瓷纳米载体修复 兔牙槽骨缺损

叶凌赟 王林红 张文涛 赵文妍

[摘要] 目的 探討 PDLSCs细胞膜片与纳米级B-TCP复合叠层三维结构对牙槽骨缺损的相关修复及治疗作用。 方法 分离及培养牙周膜干细胞，制备牙周膜干细胞生物膜片，构建PDLSCs细胞膜片与纳米级B-TCP复合叠层三维结构模型，将其植入新西兰兔缺损骨模型内，于术后第4周、第8周、第12周处死新西兰兔并分离牙周组织，通过形态学分析评判修复效果。 结果 WB结果示，Runx2、ALP蛋白的表达量比对照组分别增加9.2倍和4.3倍;移植后第8周，苏木精-伊红染色示PDLSCs细胞膜片与纳米级B-TCP复合叠层三维复合结构组新骨形成的百分比显著高于对照组及空白对照组（P<0.05）;免疫组化染色示构建PDLSCs细胞膜片与纳米级B-TCP复合叠层三维复合结构组成骨相关标志物OCN、ALP、Runx2蛋白表达高于对照组及空白对照组（P<0.05）。 结论 牙周膜干细胞膜片与B-TCP三维叠层结构复合结构可促进兔牙槽骨缺损部位的修复及再生，为临床牙槽骨缺损的治疗提供一种新的思路，有广阔的应用前景。

[关键词] 牙周膜干细胞;B-TCP;成骨标志物;牙槽骨修复

[中图分类号] R783.5          [文献标识码] B          [文章编号] 1673-9701（2019）33-0071-04

[Abstract] Objective To investigate the repair and treatment effects of PDLSCs membrane and nano-scale B-TCP composite laminated three-dimensional structure for alveolar bone defects. Methods The periodontal ligament stem cells were isolated and cultured to prepare the biomembranes of periodontal ligament stem cells. The composite laminated three-dimensional structure model of PDLSCs membrane and nano-scale B-TCP was constructed and implanted into the New Zealand rabbit defect bone model. The New Zealand rabbits were sacrificed and the periodontal tissues were isolated in the 4th week， 8th week and 12th week after surgery. The repair effect was evaluated by morphological analysis. Results WB results showed that the expression levels of Runx2 protein and ALP protein were 9.2 times and 4.3 times higher than those in the control group. In the 8th week after transplantation， hematoxylin-eosin staining showed that the percentage of new bone formation in the PDLSCs membrane and nano-scale B-TCP composite laminated three-dimensional structure group was significantly higher than that in the control group and the blank control group（P<0.05）. Immunohistochemical staining showed that expression levels of the ossification related markers such as OCN， ALP and Runx2 in the PDLSCs membrane and nano-scale B-TCP composite laminated three-dimensional structure group were higher than those in the control group and the blank control group（P<0.05）. Conclusion Periodontal ligament stem cells membrane and nano-scale B-TCP composite laminated three-dimensional structure can promote the repair and regeneration of rabbit periodontal bone defect， which provides a new idea for the treatment of clinical alveolar bone defect and has a wide application prospect.

[Key words] Periodontal ligament stem cells; B-TCP; Osteogenic markers; Alveolar bone repair

先天的畸形、外伤、牙周病及肿瘤导致口腔及颌面部骨组织缺损是临床上较复杂的一类疾病[1]。最常见的骨缺损主要是牙周病所致，这部分患者因骨量不足需植骨后方可进行治疗[2-4]。骨组织缺损的修复是当前研究热点，临床主要通过相关骨移植材料的植入，从而促进新骨形成[5]。

牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）作为来源于牙齿的间充质干细胞，体外培养时可多向分化为牙周组织相关性细胞[6]，且将细胞冻存后相关性状也不会出现较大改变[7]，故牙周膜干细胞被认为是牙周组织工程中首选的种子细胞。杨斯惠等[8]将牙周膜干细胞移植入小型猪缺损的牙周骨模型，证实其可有效提高骨缺损组织的再生及愈合。

合适的支架配合种子细胞，才能使细胞快速生长繁殖[9]。细胞膜片技术相对完整地保存了细胞外基质，在犬类动物体内也显示出了一定的牙周组织再生能力[10]。故被广泛应用于骨组织等相关组织的再生中。B-磷酸三钙（B-trical-cium phosphate，B-TCP）有良好生物降解性，骨组织填充在有机物的网状结构内，较好地补充了细胞膜片不能承受应力的缺点[11-14]，故本研究创新性地构建PDLSCs细胞膜片于纳米级B-TCP复合叠层三维结构中，探讨其对牙槽骨缺损的相关修复及治疗作用，为人体牙周膜干细胞在牙槽骨缺损的修复及应用中提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验设计

随机对照动物实验。于2016年4月～2018年6月在浙江中医药大学动物实验室完成。

1.2 所需材料

1.2.1 实验动物  健康3月龄SPF级新西兰兔9只，体重2.4～2.7 kg，由浙江中医药大学动物实验中心提供。

1.2.2 主要试剂及仪器  DMEM、胰蛋白酶、青霉素、胎牛血清、茜素红、倒置荧光显微镜（Sigma公司）;圆片状B-磷酸三钙生物陶瓷（B-TCP）（上海贝奥路生物材料有限公司）;蛋白检测系统（Bio-Rad公司）;ALP、OCN、Runx2一抗、B-actin一抗、山羊抗兔二抗、苏木精-以红染色試剂盒（Abcam 公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 牙周膜干细胞培养、PDLSCs膜片制备、成骨分化  将成年健康的雄性新西兰兔磨牙拔除，PBS冲洗后，刮取牙根终端1/3处的牙周膜组织，参照参考文献[8]的方法来进行牙周膜干细胞的培养，用胰酶将第三代牙周膜干细胞消化，再制成单细胞悬液，调整其密度至5×105/mL，再将细胞接种至100 mL培养皿，添加10 mL诱导培养液（内含VC、谷氨酰胺、青霉素、胎牛血清等），每2天换一次液，培养12～14 d后，继续观察膜片成熟的过程。如果在底面出现白色的膜样物质，边缘褶皱，则说明PDLSCs膜片已经形成。

1.3.2 PDLSCs膜片与B-TCP三维叠层结构复合结构构建  PDLSCs膜片与圆片状的B-TCP三维叠层结构复合形成三维立体结构，进行体外细胞的培养。

1.3.3 茜素红染色观察结节情况  选择不同的时段进行茜素红染色，主要用来观察钙化的结节是否形成及其具体情况，用多聚甲醛将细胞固定，后用40 mmol/L的茜素红染料对细胞进行染色，室温下放置6～10 min，观察并拍照。

1.3.4 WB检测Runx2及ALP蛋白的表达  将对照组及成骨诱导组细胞内的总蛋白提取出来以后，再检测蛋白的具体浓度。然后再取出20 μg的总蛋白行PAGE凝胶电泳，电转移至聚偏二乙烯膜上以后，用含有10%的脱脂奶粉加上TBST，封闭2 h后，再加入（1：10000）的一抗ALP、Runx2及1：20000的B-actin，4℃过夜后加入二抗，通过计算目的条带与内参条带灰度值之比，从而判断出所测的目标蛋白具体表达水平。

1.3.5 免疫荧光染色检测角蛋白、波形丝蛋白及STRO-1表达  如发现细胞内PDLSCs角蛋白阴性，波形丝蛋白阳性，则说明克隆的细胞是间充质干细胞，并且没有被来源于外胚层的细胞所污染。若荧光染色STRO-1表达为阳性，说明细胞有干细胞特性。

1.3.6  PDLSCs膜片与B-TCP三维叠层结构复合结构的动物模型制备  雄性新西兰兔动物模型制备：9只健康成年雄性新西兰兔，3%戊巴比妥1 mL/kg经耳缘静脉注射麻醉后，固定于手术台，消毒后制备直径为10 mm、深5 mm的骨缺损3个。前孔为空白对照组，中间填入PDLSCs细胞膜片作为对照组，后孔填入PDLSCs与B-TCP三维叠层结构复合结构作为实验组。缝合黏膜后常规肌注青霉素钠40万U，每天2次，共3 d，以防感染。

1.3.7 标本采集和组织学相关分析  术后随机分成三组，每组3只，分别于第4、8、12周各处死一组动物，切取标本。每组所有新西兰兔麻醉后，用200 mL生理盐水及400 mL多聚甲醛固定24 h，加入19%乙二四乙酸脱钙，置于室温下4周，每3天进行一次脱钙液的更换，然后用不同浓度的乙醇脱水，石蜡进行包埋2 h，再切成薄度约3 μm的切片，放入62℃的烤箱内20 min，然后行苏木精-伊红染色或者免疫组织化学进行染色。

苏木精-伊红染色主要是用来分析兔牙槽缺损区的具体组织形态学状况。倒置显微镜拍摄、分析后，再对新骨形成的百分比进行计算，计算公式为新生骨面积/总缺损面积×100%。

免疫组织化学染色主要是用来分析牙周膜干细胞对骨再生方面的作用，倒置显微镜拍摄，分析后对Runx2、OCN、ALP的表达量进行测定。

1.4 统计学分析

使用SPSS21.0进行相关数据分析，计量资料以（x±s）表示，采用t检验，计数资料以百分数表示，采用χ2检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 牙周膜干细胞的形态及成骨的诱导活性

茜素红染色结果表明，成骨进行诱导，14 d后牙周膜干细胞就可以形成钙化性的结节。WB结果显示，Runx2、ALP蛋白的表达量比对照组分别增加9.2倍和4.3倍。见图1。

2.2 新生骨组织形态学比较

为了检测骨缺损的骨再生，分别于术后第4、8、12周各处死一组动物，切取兔牙周骨的标本，苏木精-伊红进行染色，相关的组织形态学进行测量，对兔骨缺损的部位进行分析，见图2。第4周，三组新西兰兔新骨形成的百分比显示，差异无明显统计学意义（P>0.05）;第8周时，PDLSCs膜片与B-TCP三维叠层结构复合结构组（实验组）新骨形成的百分比显著高于空白对照组和对照组（P<0.05）;第12周时，三组兔的愈合程度较好，新骨形成的百分比差异无显著统计学意义（P>0.05）。

2.3 对ALP、Runx2及OCN免疫组化染色评价牙周膜干细胞对牙周组织再生作用

Runx2为成骨早期的标志物，第4周和第8周实验组和空白对照组及对照组相比，PDLSCs膜片与B-TCP三维叠层结构复合组Runx2阳性表达增强显著（P<0.01），见图3。第12周时三组阳性细胞数表达量均较少。

ALP为成骨早期的标志物，第4周，和其他两组相比，PDLSCs膜片与B-TCP三维叠层结构复合组（实验组）ALP阳性表达增强显著（P<0.01），见图4。第8周，PDLSCs膜片与B-TCP三维叠层结构复合组（实验组）ALP表达高于空白对照组，但实验组与对照组相比，无显著性差异。到第12周时三组的阳性细胞表达量均较少。

OCN为成骨晚期的标志物，随时间延长，OCN表达渐增高。第4周时，三组间OCN阳性细胞表达量较少，组间无显著差异（P>0.05），第8周及12周时，实验组OCN显著高于另外两组（P<0.05）。见图5。

3 讨论

为了研究牙周膜干细胞在牙周组织中再生作用的应用，本研究将牙周膜干细胞膜片与B-TCP三维叠层结构复合，制造新西兰兔牙槽骨缺损模型，將其植入骨缺损模型内，用于体内移植的研究。

PDLSCs因无支架降解的残余毒性及炎症反应、细胞外基质良好的抗张能力、细胞膜片良好的可塑性以及可分泌自分泌细胞生长因子等优势被广泛应用于缺损修复。该研究的体外实验研究结果显示，牙周膜干细胞诱导成骨分化，2周以后即出现极其显著的钙化性结节，使用茜素红进行染色，结果显示为阳性，早期骨形成的相关基因，如ALP、Runx2在成骨诱导以后也有所提高，均说明牙周膜干细胞可以作为牙槽骨缺损修复的种子细胞。

但是因为牙周组织的结构相对复杂，具有牙周膜软组织及牙骨质的硬组织，传统的PDLSCs不能抗各种形式的应力，故单纯的牙周膜干细胞膜片较难达到稳定完整的牙周复合体再生。本课题组创新性地构建PDLSCs细胞膜片与纳米级B-TCP复合叠层三维结构，旨在检测该复合材料的成骨作用。研究表明，纳米相陶瓷支架可以作为成骨细胞载体促进骨生成[15-18]。本研究将纳米级B-TCP复合叠层作为载体，构建牙周膜干细胞膜片及纳米级B-TCP复合叠层三维结构，将其移植进所造的兔牙槽骨缺损模型，继续观察其促骨修复的作用。

成骨细胞作为较为重要的功能性细胞，在骨质的生长以及骨量的平衡和维持中发挥着较为显著的作用。成骨细胞的发育主要分为增殖及基质形成、成熟和矿化这三个阶段。相关基因表达在其调节和控制中起着比较重要的作用。ALP作为成骨分化的标志性基因，主要表达于干细胞或者成骨前体细胞的分化早期。Runx2作为特异性的转录因子，分化早期即有一定量的表达，从而起到调节和控制其他相关成骨基因表达的作用。本研究免疫组化显示，牙周膜干细胞膜片与B-TCP三维叠层结构复合组在第4周时Runx2及ALP蛋白表达均显著高于空白对照组及对照组，说明牙周膜干细胞在早期就有促骨分化及成骨形成的作用。OCN作为骨的基质性蛋白，被广泛视为骨形成晚期的特异性标记物。本研究显示，移植后第8周和12周，牙周膜干细胞膜片与B-TCP三维叠层结构复合组内OCN表达显著比对照组及空白对照组高，说明牙周膜干细胞膜片及其复合结构可在骨形成的晚期促进骨缺损部位的生长及发育[19-20]。

综上，移植后的牙周膜干细胞膜片与B-TCP三维叠层结构复合结构可促进兔牙槽骨缺损部位的修复及再生，牙周膜干细胞可作为牙周组织中骨缺损的种子细胞，对其进行修复，为临床牙槽骨缺损的治疗提供一种新的思路，有广阔的应用前景。

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（收稿日期：2019-07-30）