万古霉素缓释微球复合自体浓缩红骨髓对治疗 兔桡骨骨缺损的临床研究

甘维 朱柔霖 刘雪萍 张立岩 刘斌

[摘要] 目的 探討万古霉素缓释微球复合自体浓缩红骨髓对治疗兔桡骨骨缺损的临床研究。 方法 选取2017年1～6月我院动物实验中心饲养的48只新西兰大白兔，雌雄皆可，体重2.5～3 kg，分别饲养，随机分为三组，每组16只。A组采用自体浓缩红骨髓治疗方式，B组采用自体浓缩红骨髓与纤维蛋白胶的治疗方式，C组采用万古霉素缓释微球复合自体浓缩红骨髓的治疗方式。比较三组的血清CRP水平、红细胞沉降率以及三组兔术后不同时间段X线的评分。 结果 术后3 d、7 d，B组兔血清的CRP水平与A组比较显著较低，而C组的CRP水平与B组比较显著降低（P<0.05）;术后1 d、3 d及4周A组的ESR与B、C组比较显著较高;术后7 d A、B组的ESR与C组比较显著较高;术后2周B组的ESR与C组比较显著较高，而A组又显著高于B组（P<0.05）;术后2周、4周以及8周B组及C组的X线评分显著高于A组（P<0.05），术后12周三组X线的评分比较无显著差异（P>0.05）。结论 在对兔桡骨骨缺损进行治疗的过程中，采用万古霉素缓释微球复合自体浓缩红骨髓的治疗方式，有利于改善血清CRP水平以及红细胞沉降率，同时浓缩红骨髓主要取自自体，安全可靠，具有较好的组织相容性，对于骨缺损愈合的情况有积极的促进作用，因此在临床治疗中具有较高的应用价值。

[关键词] 万古霉素缓释微球;复合自体浓缩红骨髓;兔桡骨骨缺损

[中图分类号] R687.3          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2019）33-0038-05

[Abstract] Objective To investigate the clinical study of vancomycin sustained-release microspheres combined with autologous concentrated red bone marrow in the treatment of rabbit radius defects. Methods From January 2017 to June 2017， 48 New Zealand white rabbits who were raised in the Animal Experimental Center of our hospital were selected. They were either male or female， raised separately and weighed between 2.5-3 kg. They were randomly divided into three groups， with 16 rabbits in each group. Group A was given autologous concentrated red bone marrow for treatment. Group B was given autologous concentrated red bone marrow combined with fibrin glue for treatment. Group C was given vancomycin sustained-release microspheres combined with autologous concentrated red bone marrow for treatment. The serum CRP levels， erythrocyte sedimentation rate， and the X-ray scores at different time points after surgery were compared between the three groups of rabbits. Results At 3 d and 7 d after surgery， the serum CRP levels in group B were significantly lower than those in group A， and the CRP level in group C was significantly lower than that in group B（P<0.05）; the ESR in group A was significantly higher than that in group B and C at 1 d， 3 d and 4 weeks after surgery; the ESR in group A and group B was significantly higher than that in group C at 7 d after surgery; the ESR in group B was significantly higher than that in group C at 2 weeks after surgery， while that in group A was significantly higher than that in group B（P<0.05）; the X-ray scores in group B and group C were significantly higher than those in group A at 2 weeks， 4 weeks and 8 weeks after surgery（P<0.05）. There were no significant differences in the X-ray scores among the three groups at 12 weeks after surgery（P>0.05）. Conclusion In the treatment of rabbit radius defects， the method of vancomycin sustained-release microspheres combined with autologous concentrated red bone marrow is beneficial to improving serum CRP levels and erythrocyte sedimentation rate. At the same time， the concentrated red bone marrow is mainly taken from the autologous tissues， which is safe and reliable， and has good tissue compatibility. It has a positive effect on promoting the healing of bone defects and therefore has a higher application value in clinical treatment.

[Key words] Vancomycin sustained-release microspheres; Combined autologous concentrated red bone marrow; Rabbit radius defects

在目前的骨科治疗中，大段骨缺损情况的治疗及修复仍为医学研究中的重要内容[1]。自体的松质骨由于其同时具有骨的生成、诱导以及传导的能力，因此被认为是植骨治疗中的“金标准”，但该项取骨方式的骨量较少，并且不适宜对生长发育期的儿童进行治疗;同种异体骨的骨源是目前治疗的重大难题，同时具有一定的免疫排斥的情况，不利于患者的治疗[2-3]。骨形态中蛋白情况的出现能够诱导并且募集未分化的间充质细胞向软骨以及骨细胞的分化，同时具有正位以及体内异位的能力，自体红骨髓中含有的骨源性的干细胞也具备成骨的功能，但容易导致体内流失情况的出现，因此单独将其应用于治疗的效果并不明显[4-5]。本次研究主要通过对兔桡骨骨缺损情况的实验，探讨万古霉素缓释微球复合自体浓缩红骨髓治疗的有效性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年1～6月我院动物实验中心饲养的48只新西兰大白兔，雌雄皆可，体重2.5～3 kg，分别饲养，随机分为三组，每组16只。均在无菌的条件下制造所有动物骨双侧桡骨骨缺损的模型，A组采用自体浓缩红骨髓治疗方式，B组采用自体浓缩红骨髓与纤维蛋白胶的治疗方式，C组采用万古霉素缓释微球复合自体浓缩红骨髓的治疗方式，三组动物治疗后均允许且负重在笼中进行自由活动，并同时进行肌肉注射40 IU/d的青霉素，连续注射3 d。

实验动物模型的具体制备方法为：采用10%的水合氯醛按照4 mL/kg的比例对所选用的新西兰兔进行腹腔麻醉，显露桡骨近端的备皮，依据沈霖造模法使其双侧桡骨的中上段显露，采用3 mm的斯氏针钻孔至动物的髓腔，将动物体内少量的骨髓进行抽离之后注入浓度为5%的鱼肝油酸钠5 μL，将2×109 cfu/mL的金黄色葡萄球菌悬液注入动物的髓腔内5 μL。采用无菌骨蜡将空洞进行密封，最后缝合动物的皮肤。1个月之后利用细菌培养、X线片以及病理组织的培养等确定动物是否有感染的情况出现。

1.2 方法

1.2.1 A组  采用自体浓缩红骨髓（RBM）治疗方式，RBM具体制备的方法为：采用浓度为3%的戊巴比妥钠进行静脉麻醉，依照30 mg/kg的速度推进，在无菌条件下取兔的俯卧位，采用16G的骨穿针进行髂骨穿刺，抽取1 mL的骨髓，采用1000 r/min的速度进行10 min的离心操作，然后抽取0.2 mL的底层浓缩红骨髓用以对兔的植入。

1.2.2 B组  采用自体浓缩红骨髓与纤维蛋白胶的治疗方式，自体浓缩红骨髓的治疗方式与A组相同，纤维蛋白胶工程骨的构建方式为：将纤维蛋白胶用抑肽酶按照80 mg/mL进行溶解，将自体浓缩红骨髓加入其中，使用过程中加入催化剂的溶液，等待约20 s后即呈现为凝胶状态。

1.2.3 C组  采用万古霉素缓释微球复合自体浓缩红骨髓的治疗方式，在无菌的条件下取其一侧约为1 g的髂骨，将骨膜以及软组织去除，采用球形的磨钻将其处理成骨泥，然后将其与240 mg的万古霉素缓释微球进行充分的混合备用。

用双氧水以及生理盐水进行伤口的反复冲洗后，分别将三组兔采用上述三种的治疗方式植入，操作完成后逐层缝合，并将术后的兔进行分笼喂养。

1.3 观察指标

1.3.1 三组兔血清C-反应蛋白（CRP）的水平比较  分别在动物术前及术后1 d、3 d、7 d、2周、4周抽取动物耳缘处的4 mL静脉血，取其中的2 mL以蛋白分析仪利用免疫散射比浊法检测三组不同时间段的血清CRP水平。

1.3.2 三组兔的红细胞沉降率（ESR）比较  使用剩余的2 mL利用3.8%的枸橼酸钠，在抗凝后将其加入到血沉管中进行1 h的垂直竖立，之后观察红细胞下沉的距离即为红细胞的沉降率。

1.3.3 髓腔的改建情况、骨移植区密度的变化以及骨痂生长的情况  分别在三组兔手术后的2、4、8以及12周每组各处死2只进行双前肢X线侧位片检查，主要观察内容为髓腔的改建情况、骨移植区密度的变化以及骨痂生长的情况，X线片的评分依据Lane-sandhu的骨移植组织学进行评估比较。

1.4 统计学方法

采用SPSS11.5统计学软件，计量资料用（x±s）表示，三组间不同时间点血清CRP、ESR、X线片评分及组织学评分比较采用单因素方差分析，若差异有统计学意义，则再采用LSD-t法进行组间两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组兔术前及术后血清CRP水平比较

术前三组兔的血清CRP水平无显著差异（P>0.05），术后3 d、7 d，B组兔血清的CRP水平与A组比较显著较低，而C组的CRP水平与B组比较显著降低（P<0.05），见表1。

2.2 三组兔术前及术后ESR比较

术前三组兔的ESR水平无显著差异（P>0.05），术后1 d、3 d及4周A组的ESR与B、C组比较显著较高;术后7 d A、B组的ESR与C组比较显著较高;术后2周B组的ESR与C组比较显著较高，而A组又显著高于B組（P<0.05），见表2。

2.3 三组兔术后不同时间X线评分比较

术后2周、4周以及8周B组及C组的X线评分显著高于A组（P<0.05），术后12周三组X线评分比较无显著差异（P>0.05），见表3。

3讨论

随着科技的进步以及组织工程学的不断发展，人们逐渐发现在对骨缺损的情况进行修复的过程中采用复合生长因子的人工骨修复能够显著缩短修复治疗的时间，并且将多种生长因子进行联合使用能够取得较为显著的修复效果[6-7]。在传统的治疗中无论是从动物身上提取生长因子还是基因重组均需要耗费较长的时间，同时制作的价格较为昂贵，外源性的生长因子在大多数情况下存在一定的免疫排斥反应，导致修复的效果不佳，不利于患者预后[8]。而红骨髓中包含诱导性以及定向性的骨祖细胞，具备形成成骨细胞的能力[9]。近年来国外学者通过对动物进行骨愈合的实验中表明自体骨髓移植能够加速骨的愈合，具有成骨的功能。

在对骨缺损的感染情况进行控制的过程中，应用敏感抗生素是该治疗的前提，尤其是局部抗生素的应用，局部药物的浓度较高，而全身血液中药物的浓度相对较低，所以能够对感染的情况进行有效地控制，同时避免毒副作用，利于患者治疗[10-11]。近年来受多种因素的影响，导致慢性骨髓炎病菌出现的情况易发生较大改变，并且大部分的金黄色葡萄球菌对庆大霉素产生耐药的情况。而万古霉素是在目前的治疗中耐药菌较少的抗生素的一种，主要应用于革兰阳性菌，如链球菌、表皮葡萄球菌以及金黄色葡萄球菌等[12]。万古霉素是一种碳水化合物性质的抗生素，能够有效抑制细菌细胞壁中的蛋白合成，从而促使细菌细胞膜的渗透性发生实质性的改变，从而对RNA的生物合成情况进行有效抑制，因此不容易与其他类的抗生素产生交叉耐药的情况，更加不容易导致细菌耐药性情况的出现[13-14]。根据有关实验证实，万古霉素在兔骨髓的应用中并不会影响基质干细胞的成骨分化以及增殖的情况，对骨缺损修复的情况不会产生任何影响的同时能够发挥其抗感染的功能[15]。在个体免疫的活性当中，ESR以及血清CRP水平是对急性感染情况进行评估的重要指标，并且感染的情况与CRP水平呈现正相关性，而ESR则是表示血浆与血红细胞分离直至沉降至试管底部的速率[16-17]。在本次研究中经过对三组兔桡骨骨缺损情况采用不同治疗方式的比较显示：术后3 d、7 d，B组兔血清的CRP水平与A组比较显著较低，而C组的CRP水平与B组比较显著降低（P<0.05）;术后1 d、3 d及4周A组的ESR与B、C组比较显著较高;术后7 d A、B组的ESR与C组比较显著较高;术后2周B组的ESR与C组比较显著较高，而A组又显著高于B组（P<0.05）。从各组之间ESR以及CRP水平的变化中发现，抗生素在局部中的应用均能在兔骨缺损感染的情况中发挥积极的功能。ESR随着骨缺损清创术材料的植入其表达的水平增加，但增加的情况不如CRP迅速，在感染的情况得到控制后，ESR与CRP比较恢复到正常值所需要的时间相对较长[18]。因此，感染情况是否得到有效控制可以通过CRP水平的检测情况显示，而ESR虽然能够表达感染的情况，但不能将其用作敏感指标[19-20]。在本次研究中经过对三组X线片的评估比较显示：术后2周、4周以及8周B组及C组的X线评分显著高于A组（P<0.05），术后12周三组X线的评分比较无显著差异（P>0.05）。在早期感染情况的存在导致A组骨质塑形的情况相对较慢，而B组药物的半衰期时间较短，在前期能够显著降低由于感染情况而对成骨造成的损伤，由于后期动物的抵抗力情况相对较强，缓释药物的情况与修复的情况基本相同，因此在术后12周三组的X线评分无显著的差异。

综上所述，在对兔桡骨骨缺损进行治疗的过程中，采用万古霉素缓释微球复合自体浓缩红骨髓的治疗方式，有利于改善血清CRP水平以及红细胞沉降率，同时浓缩红骨髓主要取自自体，安全可靠，具有较好的组织相容性，对于骨缺损愈合的情况有积极的促进作用，因此在臨床治疗中具有较高的应用价值。

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（收稿日期：2019-07-03）