金针菇黄酮类化合物的体外抗氧化活性研究

刘兰庆，汪鋆植，倪炎＊

三峡大学，湖北宜昌443002；2.武汉华夏理工学院，湖北武汉 430223）

金针菇黄酮类化合物是其生物活性成分，方玉梅等人通过邻苯三酚自氧化法、水杨酸法比色法分别测定了金针菇的黄酮类化合物清除超氧阴离子自由基（·O2-）和羟基自由基（OH·）的效果，结果表明，金针菇黄酮提取液清除超氧阴离子自由基和羟基自由基的效果是相当显著的，且其抗氧化性作用伴随着金针菇黄酮类化合物浓度的增大而增大。后来缪成贵等人采用烘箱储藏法测定金针菇总黄酮抗油脂氧化作用，结果表明金针菇总黄酮对猪油的氧化具有明显的抑制作用，且随着质量分数的增大其抗氧化能力增强，强有力证明了金针菇总黄酮具有一定的抗氧化作用[2]。目前对金针菇活性氧的研究比较多，而本课题则是从更多方面对金针菇黄酮类化合物的抗氧化活性进行探讨，为研究金针菇黄酮类化合物的抗氧化活性研究提供了参考依据。

1 实验方法

1.1 粗金针菇黄酮溶液的提取及含量的测定

采用微波辅助法提取金针菇黄酮类化合物。（1）样品的处理：将金针菇置于烘箱中60摄氏度烘干，研磨用80目的筛子过筛。（2）取金针菇中总黄酮：准确称取烘干的金针菇适量，置于锥形瓶中，并且加入一定浓度的乙醇溶液后，在微波功率539W的条件下微波设置好的时间；再准确汲取所需用量的粗黄酮提取液，最后置于容量瓶中定量。

1.2 金针菇黄酮溶液含量的测定

以芦丁标准品溶液的浓度为横坐标，以吸光度作为纵坐标，得到标准曲线，对测得的数据进行线形回归分析。用比色法测定金针菇黄酮溶液的吸光值，以金针菇黄酮提取液的浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标制作出标准曲线，将样品吸光值带入回归方程得到金针菇黄酮溶液浓度。

1.3 金针菇黄酮溶液体外抗氧化活性研究

1.3.1 羟基自由基的清除能力的测定

利用Fenton反应原理，通过邻二氮菲-亚铁法测定，参考方玉梅[1]的测定方法。

1.3.2 过氧化氢的清除能力的测定

采用紫外法，通过H2O2溶液的吸光度和加入样品液的H2O2溶液吸光度的变化值来了解样品液的清除效果。方法如下：以pH=7.40的磷酸盐缓冲溶液配制10mmol/L H2O2溶液。取5mL上述溶液加入5mL不同浓度的样品液，均匀混合后用紫外可见分光光度计测定其在230nm处的吸光值A1。实验中以不加样品液的H2O2溶液吸光值为A0，以不加H2O2溶液的样品溶液的吸光值为A2，按式1-1计算则可得出过氧化氢清除率。

A0为H2O2溶液的吸光度

A2为样品液的吸光度

1.3.3 超氧阴离子自由基清除能力的测定

通过邻苯三酚自氧化法，参考方玉梅[1]的测定方法。

取14支干燥洁净的离心管，1～5号试管中加入0.2mol/l的Tris-HCl缓冲溶液（PH=7.4）4.5mL，然后加入5、10、20、30、40µg/mL浓度的金针菇黄酮溶液2.0mL（其中6～10号试管以等量蒸馏水代替不同浓度的2.0mL样品液），放入25℃水浴锅中水浴10min，取出后加25℃预温的10mmol/l邻苯三酚溶液1.0mL，混合均匀，加邻苯三酚时开始计时，反应三分钟后加12mol/L的浓盐酸终止，10min后，在325nm处测得吸光值A，按式1-2计算清除超氧阴离子的清除率(E)，然后测定三次的平均值。

A0：用2.0mL的蒸馏水取代样品液

1.3.4 DPPH自由基的清除能力的测定

Nagai法，参考方玉梅[3]的测定方法。

取2.0mL 5、10、20、30、40µg/mL浓度的金针菇黄酮溶液置于1～5号干燥洁净的10mL离心管中，6号离心管中加入2.0mL的无水乙醇，随后各离心管中分别加入3.0mL 0.2mmol/LDPPH溶液，7号离心管加2.0mL无水乙醇和2.0mL样品溶液为对照，

振荡摇匀，遮光反应30min后，在517nm处测定吸光度，按式1-3计算清除DPPH自由基的清除率(E)，实验结果为三次测定的平均值。

A i：2.0mL待测液加3.0mLDPPH溶液 1～5号离心管

Ac：2.0mL无水乙醇加3.0mLDPPH溶液 6号离心管

对照：2.0mL无水乙醇加2.0mL样品溶液 7号离心管

1.4 统计与分析

使用DPS9.0进行分析，对不同浓度的黄酮溶液的活性氧清除能力进行显著性检验，从而对金针菇黄酮溶液体外清除活性氧的效果进行进一步比较分析。

2 结果与分析

2.1 金针菇黄酮类化合物浓度的测定结果

利用芦丁标准品溶液得到线性方程为y=14.8x-0.0104，相关系数R2=0.9985，表明拟合方程线性关系良好。如图1所示。

图1 标准品溶液的浓度与吸光度的关系

在510nm处测得金针菇黄酮提取液的吸光度y=1.402，根据公式计算得到金针菇黄酮提取液的浓度为95μg/mL。

向50mL容量瓶中分别取金针菇黄酮提取液2.6、5.3、10.5、15.8 mL和21.1mL，然后均加入80%的乙醇溶液至刻度线，得到不同浓度梯度的金针菇黄酮样品液，5、10、20、30 μg/mL和40 μg/mL，记为样品1～5。

2.2 金针菇黄酮类化合物对OH·的清除效果

从图2看出，金针菇黄酮溶液对OH·拥有良好的清除能力，而且随着浓度的提高，清除率也在不断的提高，最高清除率到达了81.00%以上。不同浓度的金针菇黄酮提取液之间有显著差异，随着浓度的不断升高，从低浓度的5μg/mL，升到浓度为40μg/mL，清除OH·的能力在不断提升，但高浓度下对提升OH·的清除能力并不显著。说明金针菇黄酮提取液OH·清除能力与其浓度是存在一定的正协同性，适当的提高黄酮溶液的浓度，可以提高金针菇黄酮提取液的抗氧化活性。

2.3 金针菇黄酮类化合物对过氧化氢的清除效果

从图3看出，金针菇黄酮溶液具备比较好的过氧化氢清除能力，浓度为40μg/mL时过氧化氢清除率达到了96.00%以上。不同浓度的金针菇黄酮溶液之间差异并不显著，即使在5μg/mL的浓度下，清除率也能达到94.67%，接近100%，再提高黄酮的浓度，其清除率并没有显著性提高。

图2 黄酮提取液对OH·的清除效果

图3 黄酮提取液对过氧化氢的清除效果

2.4 金针菇黄酮类化合物对O2-·的清除效果

从图4看出，金针菇黄酮溶液有比较好的超氧阴离子自由基（O2-·）清除能力，一定条件下，在浓度为5μg/mL时，清除率为94.75%，伴随着浓度的上升，对O2-·的清除率也在逐渐的增强，在40μg/mL浓度下，清除率高达96.63%。不同浓度的金针菇黄酮溶液之间有极显著差异，随着样品液浓度的不断增大，清除率几乎接近100%，由此看出金针菇黄酮溶液O2-·清除能力与其浓度呈正相关，适当的增大黄酮溶液的浓度能提高金针菇黄酮类化合物的抗氧化活性。

图4 黄酮提取液对O2-·的清除效果

2.5 金针菇黄酮类化合物对DPPH自由基的清除效果

从图5看出，金针菇黄酮溶液有比较好的DPPH自由基清除能力，一定条件下，伴随着浓度的上升，DPPH自由基清除率也在逐渐的上升，黄酮浓度在5μg/mL时对DPPH自由基的清除率仅为32.26%，适当提高浓度到10μg/mL时其清除率就能达到64.09%，而后再提高黄酮浓度对清除DPPH自由基的能力提升并不明显。不同浓度的金针菇黄酮溶液之间有差异，而且较高浓度的金针菇黄酮溶液清除DPPH自由基的效果更为显著，可以通过改变黄酮提取液的浓度来改变金针菇黄酮类化合物的活性。低浓度下金针菇黄酮能对DPPH自由基的清除能力较弱，但在较高浓度下时，就能有效清除DPPH自由基。

图5 黄酮提取液对DPPH的清除效果

3 讨论

生物机体中常见的自由基有羟基自由基（OH·）、过氧化氢（H2O2）、超氧阴离子自由基（O2-·）、DPPH自由基。羟基自由基（OH·）相对于其他的自由基来说，其氧化能力很强，是已知的最强的氧化剂之一，因为体内没有清除OH·的机制，所以它能够对身体造成强有力的破坏。而过氧化氢，它能够造成各种各样的疾病，给人造成危害，它会消耗体内抵抗氧化性的物质，从而导致人的抗氧化能力降低，它是一种强氧化剂，另外过氧化氢还能够导致癌性，比如通过与食物中的淀粉形成环氧化物从而达到致癌的效果，尤其是消化道癌症[4]。O2-·也属于一种活性氧，具有很强的氧化性，同时人体内也不具备清除它的能力，在体内产生极大的危害性。

本研究发现，不同浓度的金针菇黄酮溶液在一定条件下对OH·的清除率表现出了正协同性，随着浓度的增大，清除OH·的能力越来越明显。通过测定不同浓度的金针菇黄酮溶液在一定条件下对过氧化氢的清除率，发现金针菇黄酮溶液对过氧化氢清除能力很强，即使在低浓度条件下，依然可以有极高的过氧化氢清除能力。通过测定不同浓度金针菇黄酮溶液对O2-·的清除效果，发现金针菇黄酮溶液能够在一定程度上清除O2-·自由基，效果显著，而且清除O2-·自由基的能力与金针菇黄酮溶液的浓度有很大的联系，具体趋势是呈正相关的。通过测定不同浓度金针菇黄酮溶液对DPPH·的清除效果，发现在有黄酮溶液存在时，自由基会被清除，金针菇中的黄酮溶液清除DPPH 自由基的能力强，即便在浓度不太高的情况下也能够达到相当不错的清除效果。最后通过测定不同浓度的金针菇黄酮溶液的还原力，了解到金针菇黄酮溶液的浓度与其还原能力有相关性，并且表现出明显的正比关系，说明其能够在体内有效的清除自由基，具有较强的抗氧化性。

通过实验得出结论：金针菇黄酮化合物能有效清除OH·、H2O2、O2-·、DPPH自由基，并且具有较强的还原能力。清除OH·、O2-·自由基的能力与金针菇黄酮溶液的浓度是呈正比趋势的，而对H2O2和DPPH的清除能力，即便在低浓度的条件下清除效果也很好。说明金针菇黄酮化合物具有良好的抗氧化活性。