5份桉树种质耐寒性指标的测定及其评价

王 珺，李 晔，张晓勉，高智慧，郭 亮，岳春雷，李贺鹏



5份桉树种质耐寒性指标的测定及其评价

王 珺1，李 晔2，张晓勉1，高智慧3，郭 亮4，岳春雷1，李贺鹏1

（1.浙江省林业科学研究院，浙江 杭州 310023；2.浙江环科环境研究院有限公司，浙江 杭州 310007；3.浙江省林业技术推广总站，浙江 杭州 310020；4.台州市椒江区农林局，浙江 台州 318000）

以5份桉树种质（邓恩桉20784，邓恩桉.99/01，溪谷桉.02/08，邓恩桉.98/27，柳叶桉.01/19）的离体叶片为试验材料，通过低温（－7℃）胁迫，测定叶片超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化物酶（POD）活性、膜脂过氧化产物丙二醛（MDA）含量、可溶性蛋白（SP）含量、半致死温度（LT50），采用相关性分析、主成分分析和聚类分析评价其耐寒性。结果表明：5份桉树种质的低温半致死温度分别为－4.3，－5.31，－3.6，－5.16，－4.73℃。相关性分析显示，SOD活性、POD活性、SP含量均与耐寒性呈正相关，其中SOD活性与耐寒性显著正相关（r＝0.982**）；对各指标主成分分析表明，SOD活性和POD活性2个主成分解释了原变量85.52%的变异信息，根据综合指数的抗寒性排序为2号邓恩桉99/01>4号邓恩桉98/27>1号邓恩桉20784>3号溪谷桉02/08>5号柳叶桉01/19；通过聚类分析，将5份桉树种质抗寒性划分为2类，其中耐寒性较强的种质是2号和4号，耐寒性较弱的是1号、3号和5号。由此得出结论：SOD活性和POD活性是反映5份桉树种质抗寒性的两个重要指标，2号邓恩桉和4号邓恩桉为相对耐寒种质，更适合浙江生长。

桉树；耐寒性；生理指标；主成分分析；聚类分析

桉树是桃金娘科Myrtaceae桉属植物的统称，为常绿阔叶速生树种，全世界有900余种，大多数原产于澳大利亚[1]。桉树喜温暖，需强阳光，具有适应性较强、生长快等特点，在热带、南亚热带、中亚热带南部等地区显示出很高的生产力[2]。但由于桉树畏寒和对低温敏感特性，限制了桉树的向北扩展[3]。实际上，桉树中有很多优良种质可以耐受－10℃左右的低温，近年来，国内桉树界在桉树北移工作中做了大量的工作，工作重心在引种方面。如河南、湖南、福建、江西赣南地区等地均开展了耐寒桉树无性系引种和造林区域试验及相关研究[4-8]，取得了较好成效，但在江浙地区，低温仍是桉树引种、扩大栽培与速生丰产的主要限制因子，因此有必要对桉树的抗寒性进行研究探讨，筛选出适合浙江省建设速生工业用材林的桉树种质进行推广，推动桉树产业的发展。

据报道，桉树各种类、种源的耐寒性确实存在明显的差异，而关于桉树耐寒性评价，国内外学者已经提出众多与耐寒性测定有关的生理生化指标，如可溶性蛋白、电导率等[9-10]。由于桉树的耐寒性是许多数量或质量遗传基因综合作用累加的结果，单一指标评价桉树耐寒性具有片面性，用多个指标进行综合评价才较为可靠。本研究通过对5份不同桉树种质叶片超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、过氧化物酶（peroxidase, POD）、膜脂过氧化产物丙二醛（malondialdehyde, MDA）含量、可溶性蛋白质（soluble protein, SP）含量的研究，运用主成分、聚类等分析方法简化指标，初步判定5份桉树种质的综合得分，并探讨这些生理指标与植物抗寒性强弱的重要参考指标半致死温度（semi-lethal temperature，LT50）的关系，为桉树耐寒指标的选择及耐寒种质的筛选提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

浙江省林业科学研究院于2000年7月引自澳大利亚的5份桉树种质分别为：1号邓恩桉.20784，2号邓恩桉99/01，3号溪谷桉.02/08，4号邓恩桉98/27，5号柳叶桉.01/19，种子引进后2013年1月在浙江省林业科学研究院大棚进行播种育苗，2014年6月将苗木移栽至规格为20 cm×20 cm的花盆中，每盆栽种l株，每份种质栽种30株，以蛭石：珍珠岩：沙（2:2:l，体积比）的混合材料作为栽培基质进行培养，培养期间每3 ~ 5 d浇水1次，以保持土壤湿度。缓苗1个月后，于2014年7月中旬，每份种质选择生活力强、无病虫害且长势一致的小苗各10株，同一种质采集当年抽梢中下部的正常功能叶40片作为供试材科。

浙江省林业科学研究院位于杭州市市郊，120°01′ E，30°13′ N，属中亚热带北部气候，温暖湿润，四季分明，年降水量1 992.5 mm，年蒸发量1 182.6 mm，年均相对湿度81%。年均气温16.5℃，绝对最高气温度40.5℃，绝对最低气温度－7℃，无霜期240 d。

1.2 测定方法

将供试材料分为3个重复（每重复10片）用蒸馏水冲洗5遍后用纱布擦干，装入聚乙烯膜中，置于－7℃冰箱中处理24 h后取出进行指标测定。每份种质10片树叶设4℃保持24h为对照组（CK）。

MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法[11]；SP含量采用考马斯亮蓝G-250染色法[12]；SOD活性测定采用氮蓝四唑（NBT）方法，POD活性测定采用愈创木酚法[13]。半致死温度由电导法测定出相对电导率[14]，再利用Logistic方程=/（1+-bt）计算得出，其中，为实测细胞伤害率；代表冷冻温度；为细胞伤害率的饱和容量；，为方程参数为自然常数。

1.3 数据处理与分析

应用Microsoft Excel 2003软件，计算各生理指标的平均值及平均值与对照组的差值、P值。采用SPSS软件，进行主成分、聚类等相关分析。

2 结果与分析

2.1 主成分分析

选取SOD活性，POD活性，MDA含量和SP含量4个指标对桉树耐寒性进行研究。将5份桉树种质CK组与－7℃处理组各生理指标值进行分析，差值为处理平均值与对照平均值的差值（表1）。

表1 5份桉树种质生理指标值分析

Table 1 Physiological index and analysis of 5germplasm

注：<0.05表示显著性差异，<0.01表示极显著性差异。

表1表明，低温处理后的4项指标与对照组之间均存在显著（<0.05）或极显著差异（<0.01）。为了对指标进行分类，找出重要的影响因子，以这4个指标为自变量运用SPSS软件进行主成分分析，结果见表2和表3。由表2可以看出，第一主成分和第二主成分的贡献率分别为63.06%和22.46%，其累计贡献率已经达到85.52%，表明前2个主成分基本已包含了全部测量指标所具有的信息。表3中，第一主成分在SOD活性，POD活性，SP含量的特征值较大，因此第一主成分可以看作是有SOD活性，POD活性和SP含量构成的因子；第二主成分在MDA指标上的系数较大，因此可以看作是由MDA构成的因子。

表2 5份桉树种质抗寒性指标的特征值及贡献率

Table 2 The eigen value and contribution rate of cold resistance of 5germplasm

表3 各主成分特征向量

Table 3 The eigen vector of principle components

通过计算主成分得分（表4）可知，4号和2号桉树在第一主成分得分较高，说明这两份种质SOD活性，POD活性和SP含量较高，3个指标在调节促进耐寒性能方面作用较强，两份种质耐寒性较强；5号桉树在第二主成分上得分较高，说明其MDA含量较高，质膜损伤程度较严重，耐寒性较弱。结合5份桉树种质生理指标值进行综合打分（表5），得出5份桉树种质的抗寒性顺序依次为2号>4号>1号>3号>5号。

表4 5份桉树种质抗寒性主成分得分

Table 4 Components scores of cold resistance of

表5 5份桉树种质抗寒性综合打分法计算

Table 5 The comprehensive scoring method of cold resistance of

2.2 SP含量，MDA含量，SOD活性，POD活性与LT50的关系

LT50是植物抗寒性强弱的重要参考指标，能较好地反映出该植物的抗寒能力。利用Logistic方程计算得出5份桉树种质的LT50分别为－4.3，－5.31，－3.6，－5.16，－4.73℃（图1）。

图1 5份桉树种质的LT50

Figure 1 Semi-lethal temperature of 5germplasm

对SOD活性，POD活性，MDA含量，SP含量和LT50这5项指标进行相关性分析，结果见表6。由表6可知，SOD，POD是植物体内的内源保护酶系统，具有保护生物免遭逆境伤害的重要作用。5份桉树种质的SOD活性顺序依次为4号>2号>5号>1号>3号，POD活性顺序依次为4号>2号>5号>3号>1号，分别与种质的抗寒性呈显著正相关和正相关（r＝0.982**，r＝0.681），即种质的SOD活性，POD活性越大，其抗寒能力就越强，是反映植物抗寒性的两个重要指标。MDA是膜脂过氧化的主要产物，其含量的变化是质膜损伤程度的重要标志之一。5种桉树的MDA含量顺序依次为5号>3号>1号>2号>4号，与抗寒性呈负相关（r＝－0.197）。5种桉树的SP含量顺序依次为2号>4号>3号>5号>1号，不同种类的桉树其叶片SP含量与抗寒性之间存在一定的正相关（r＝0.726），表明种质的抗寒性越强，SP含量越高，但未达显著水平。

表6 5份桉树种质各项生理指标值之间的相关系数

Table 6 Correlation coefficient of physiological index among 5germplasm

2.3 聚类分析

应用SPSS软件上选择系统聚类法中的组间连接的聚类方法，以SP含量，MDA含量，SOD活性，POD活性和LT50为自变量，对不同种质桉树的抗寒性进行聚类分析，输出聚类分析树状图（图2）。

图2 5份桉树种质抗寒性聚类分析

Figure 2 Cluster analysis on cold resistance of 5germplasm

由图2可以看出，5份种质根据耐寒性可以分为三类：2号和4号为一类，为5份种质中相对耐寒的；1号和3号为一类，为5份种质种中中等耐寒的；5号为一类，为5份种质种中相对不耐寒的。

3 结论与讨论

植物生理过程错综复杂，受多种因素影响。SP是重要的渗透调节物质和营养物质，它们的增加积累能提高细胞的保水能力，对细胞的生命物质及生物膜起保护作用[15]。在许多试验中，如关于核桃，茶的耐寒性研究，抗寒锻炼期间SP含量与植物抗寒性存在密切关系[16-17]。本研究表明，5份桉树种质的SP含量与抗寒性呈正相关性，这与其他的研究结果也相一致。

正常情况下，植物体内的MDA含量极少[18]。在低温胁迫下，细胞内活性氧代谢的平衡被破坏，从而有利于活性氧的产生。活性氧过剩的毒害之一是引发或加剧膜质过氧化的作用，造成细胞膜系统的损害[19]。MDA含量越高，植物伤害程度就越大。通过本次试验，进一步证实低温胁迫后MDA的增量与桉树的抗寒性之间存在一定负相关，即MDA含量高的桉树种质抗寒性弱，反之则强。

许多研究表明，低温胁迫条件下植物体内超常积累活性氧自由基，这些自由基与活性氧的超常积累，对许多生物功能分子有破坏作用[20]。同时植物细胞内也存在消除自由基的多种途径，如SOD可以消除O2-，使O2-氧化成为H2O2，而植物体内的POD可以进一步分解H2O2，使得植物抵抗在逆境胁迫下代谢过程产生的有害物质对细胞的伤害，从而表现出一定的抗逆性[21]。本试验结果表明，SOD，POD活性与植物抗寒性成正相关，是反映植物抗寒性的两个重要指标。

影响植物抗寒性的因素是多方面的，如果使用单一指标或多个指标分别评价其抗寒性必定会造成偏差。本试验通过对5份桉树种质SOD活性，POD活性，MDA含量，SP含量和LT50进行相关分析，用主成分分析法并结合生理指标进行综合打分，得出5份桉树种质的LT50由强到弱依次为：2号邓恩桉99/01>4号邓恩桉98/27>1号邓恩桉20784>3号溪谷桉02/08>5号柳叶桉01/19，并通过聚类分析5份桉树种质分为3类，其中2号邓恩桉99/01和4号邓恩桉98/27为相对耐寒树种，为桉树抗寒性选育和生产发展提供依据。

在桉树抗寒机理尚未得到充分揭示的情况下，真正反映抗寒性的指标还未有一致的看法。本试验只选择了部分生理指标，若要全面鉴定桉树的耐寒性，应选择多项指标（生态及生理的），供试的材料应具有各抗性类型的代表性桉树种类，在研究时期的选择上，应对不同树龄、不同生长季节的桉树进行取样分析，并结合人工低温处理进行综合分析评价，才能得到评价桉树耐寒性的科学依据，更好地挖掘桉树抗寒种质资源，将会是今后研究的重点。

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Determination and Evaluation on Cold Resistance of 5Germplasm

WANG Jun1，LI Ye2，ZHANG Xiao-mian1，GAO Zhi-hui3，GUO Liang4，YUE Chun-lei1，LI He-peng1

（1Zhejiang Academy of Forestry, Hangzhou 310023, China; 2.Zhejiang Environmental Institute Co.Ltd, Hangzhou 310007, China; 3.Zhejiang Forestry Extension Administration, Hangzhou 310020, China; 4.Taizhou Jiaojiang Agro-forestry Bureau of Zhejiang, Taizhou 318000, China）

Seeds of20784,99/01,02/08,98/27,01/19 were imported from Australia in July of 2000，sowing and seedling was carried out in Hangzhou of Zhejiang in January of 2013.40 leaves were collectedfrom each germplasm and treated by -7℃ and 4℃in July of 2014 for determination of SOD, POD, MDA, SP and LT50.Correlation analysis on determined index demonstrated that SOD, POD and SP had positive relation with cold resistance, especially SOD had significant relation.Principle component analysis indicated that SOD and POD occupied 85.52% of variable.Cold resistance of tested germplasm was ordered by comprehensive index.Cluster analysis concluded that cold resistance of 5 germplasm could be divided into 2 groups.

; cold resistance; physiological index; principal component analysis; cluster analysis

S792.39

A

1001-3776（2018）05-0045-06

2017-12-16；

2018-05-13

浙江省省属科研院所专项项目（2017F30016）；浙江省林业厅林业推广项目（2012B09）；台州市农业类一般项目（162hb02）

王珺，助理研究员，从事湿地生态研究；E-mail：47935927@qq.com。

张晓勉，副研究员，从事植物抗逆研究；E-mail：82236545@qq.com。

10.3969/j.issn.1001-3776.2018.05.008